非综合征耳聋患者12SrRNA和GJB2基因变异及分子遗传学研究

摘要

目的 1.完善浙江省非综合征型耳聋资源数据库，对本省聋校儿童发病原因及分子机制进行研究。 2.收集温州、温岭两地聋校非综合征耳聋患者血样192例，进行线粒体12S rRNA基因及细胞核编码缝隙连接蛋白26(connexin26，Cx26)的GJB2基因变异分析，并将分析结果与本课题组前期收集的6所聋校儿童的线粒体12S rRNA基因变异进行汇总比较，完善本省药物性耳聋儿童监控系统。 3.响应“爱耳日”的号召，对杭州、温州两地非综合征型耳聋患者进行12S rRNA、GJB2基因变异筛查，对耳聋进行早期诊断、干预及治疗。同时为患者提供遗传及优生优育咨询以降低本省耳聋发病率，减少耳聋患者总体人数，最终将实验室研究成果应用造福于社会。 4.对样本中筛查到的3个携带GJB2复合杂合突变的非综合征耳聋家系进行聋病相关性探讨，为其聋病的发生提供诊断依据。 方法 1.依据本课题组耳聋分子流行病学调查工作程序，对收集的293例非综合征型耳聋患者进行血样、临床资料、家系资料的收集与整理。 2.提取所收集血样全基因组DNA。 3.对提取的全基因组DNA分别进行线粒体12S rRNA与GJB2基因扩增、纯化及测序。 4.将测序结果与标准序列进行比对，统计变异类型 5.将2所聋校儿童线粒体12S rRNA基因结果与前期本课题组收集的6所聋校患儿资料进行比较分析，探讨其分子生物学发病机制。 6.对2011年“爱耳日”收集的101例样本进行线粒体12S rRNA基因与GJB2基因相关耳聋突变分析。 7.将293例非综合征型耳聋患者的GJB2基因变异进行统计，并对所筛查到的3个携带GJB2复合杂合突变的非综合征耳聋家系进行分子遗传学分析，明确其发病原因。 结果 1对8所聋校的551例聋儿进行线粒体12S rRNA基因变异进行统计，共检测到35种变异类型。发现了23例携带同质性1555A>G突变，占全部患儿的4.2％。另发现3例患儿携带与耳聋相关的1095T>C突变，13例患儿携带961位点的突变，包括961insC，961T>C，961T>CC。 2将新收集的192例聋儿样本与前期收集聋儿样本线粒体12S rRNA基因变异进行比较，发现患儿携带同质性1555A>G突变的人数由原来的5.1％下降到2.6％，患儿携带与耳聋相关的1095T>C突变为0.5％，下降了0.1％，且961位点突变筛查出了新的突变类型961T>CC。 3对2011年“爱耳日”收集的101例患者进行12S rRNA基因与GJB2基因分析，发现3例患者携带1555A>G同质性突变，核基因GJB2上共筛查出11种碱基改变类型，且均为常染色体隐性突变。在亚洲人群中最常见的235delC突变率达到9.9％，同时发现了两种致病性的复合杂合突变：35insG+/-/235delC+/-和235delC+/-/299delAT+/-。 4对收集的293例样本进行GJB2基因突变类型统计，发现17种碱基改变类型。缺失/移码突变有4种，分别为35delC、235delC、176dell6bp和299 delAT，插入突变有2种类型35insG、512insAACG。其中发生235delC纯合突变的有27例，突变率达到9.22％，此外，还检出同时携带两种致病性突变的复合杂合突变14例。 5对检出的同时携带两种致病性突变的复合杂合突变：35insG/235delC复合杂合突变2例及35delG/235delC复合杂合突变1例共3例患者，通过遗传学分析，认为GJB2基因上发生的复合杂合突变是这3个家系发生耳聋的重要致病原因。 结论 1对8所聋校的551例患者进行线粒体12S rRNA基因变异进行统计，发现了23例携带同质性1555A>G突变，占全部患者的4.2％，另发现3例患者携带与耳聋相关的1095T>C突变，13例患儿携带961位点的突变，说明线粒体12S rRNA基因，是氨基糖甙类药物导致的药物性耳聋的突变热点区。 2将新收集的192例患者样本与前期收集患者样本的线粒体12S rRNA基因变异进行比较，发现患儿携带同质性1555A>G突变的人数由原来的5.1％下降到2.6％，同时也发现了新的变异类型，完善了浙江省耳聋数据库。同时也证明了本省的耳聋基因筛查工作是一项持久而艰巨的工作。 3对293例耳聋患者进行核基因GJB2突变统计，发现在亚洲耳聋人群中最常见的致病位点235delC纯合突变27例，突变率达到9.22％；同时携带两种致病性突变的复合杂合突变14例。说明235delC纯合突变与致病性的复合杂合突变是本研究对象发生耳聋的主要原因。这些研究数据为其隐性遗传性耳聋发生提供了分子诊断依据，同时可为这些患者家庭进行准确的遗传咨询，控制耳聋的发病率。 4对3个GJB2基因上携带复合杂合突变的耳聋患者进行遗传学分析，认为GJB2基因上发生复合杂合突变是这3个家系发生耳聋的重要致病原因。可为这3个家系建立基因档案，为其后代在婚配中提供遗传咨询与指导，避免该家庭生育相同基因型的儿童，防止耳聋的再次发生。