重组人成纤维细胞生长因子21对油菜遗传转化的研究

摘要

成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor-21，FGF-21)是在小鼠胚胎中发现的成纤维细胞生长因子家族的一个新成员，是肝脏合成的一种可分泌多肽。FGF-21 mRNA主要在肝脏大量表达，在胸腺内低水平表达，脂肪组织可能是其重要靶组织。FGF-21与FGFs家族其他成员不同，它对细胞的有丝分裂不具有促进作用，并且其可以不与肝素的结合就发挥生物活性。同时它能调节组织细胞中的糖脂代谢，增加机体对胰岛素的敏感性，具有与胰岛素类似的作用。其生物学功能主要体现在糖脂代谢调控方面，可降低血糖，改善血脂，而且不会导致低血糖，有望成为治疗Ⅱ型糖尿病的理想药物。 目前，大部分药用蛋白都通过微生物发酵获得，生产成本高昂。而利用植物生物反应器表达动物来源的蛋白，能够大大降低外源活性蛋白的生产成本。而且植物表达系统拥有许多微生物表达系统所没有的优点，因此，利用植物基因工程使FGF-21能够在植物中获得表达，对未来FGF-21的产业化研究具有一定重要意义。 油菜作为重要的经济作物，近年来利用转基因技术对其进行品种遗传改良的研究越来越多。但是，油菜不定芽再生能力和转化频率受基因型、外源激素等多种因素的影响，优化油菜不定芽再生及遗传转化系统是成功进行油菜遗传转化的必要前提。 本研究以甘蓝型油菜沪油16为实验材料，从外植体选择、激素配比、AgNO3等方面对沪油16油菜离体再生进行了研究，建立了沪油16油菜高效离体再生体系。同时通过对影响农杆菌转化效率的几种因素的研究，初步建立了一套农杆菌介导法的油菜遗传转化体系。结果如下： 1.通过研究油菜子叶和下胚轴外植体在不同激素配比的培养基上愈伤组织诱导情况，结果表明：①子叶与下胚轴均能诱导出淡黄色、疏松的愈伤组织，两者无显著差异；②子叶与下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基为：MS+1.0 mg/L2，4-D。 2.通过对油菜子叶和下胚轴在不同激素配比的不定芽诱导培养基上不定芽诱导的研究，结果显示：①子叶与下胚轴均能诱导出不定芽，并发育成完整的植株；②在相同培养条件下，下胚轴的不定芽诱导能力要高于子叶；③子叶与下胚轴不定芽诱导最佳培养基都为：MS+5.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA。 3.通过对不定芽的根诱导的研究发现，根诱导最佳培养基为不添加任何激素的1/2 MS培养基。 4.通过不同浓度AgNO3对下胚轴不定芽诱导影响的研究，得出：①在一定浓度范围内添加AgNO3能显著提高下胚轴的不定芽诱导能力；②最佳AgNO3添加浓度为5.0mg/L。 5.通过对影响农杆菌遗传转化效率因素的研究，结果显示：①最适宜的浸染时间为15min；②菌体浸染液浓度为OD600＝0.4-0.6；③选用的筛选抗生素Hyg浓度为6.0mg/L，抑菌剂Carb为400mg/L。 6.本实验利用农杆菌介导法，将载体p1390yoFGF-21转化油菜沪油16下胚轴，经潮霉素抗性筛选获得13株抗性植株，通过PCR扩增和检测分析，初步表明重组人FGF-21已整合到油菜基因组中，转化率为7.47％左右。 7.本实验对转基因植株进行了生长发育的研究，表明外源基因的插入对油菜的生长发育有一定程度的影响。