ST6Gal1--shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究

摘要

目的： 1.考察ST6GAL1及在不同肿瘤细胞中的表达情况； 2.考察较低浓度紫杉醇持续刺激卵巢癌细胞OVCAR3对其ST6GAL1表达的影响； 3.考察利用sh-RNAi技术下调乳腺癌细胞ST6GAL1表达后，其细胞迁移能力、对ECM粘附能力和紫杉醇诱导的细胞凋亡等的变化，并探讨其内在的分子机制。 方法： 1、用荧光定量PCR技术检测不同肿瘤细胞的ST6GAL1的表达水平。 2、使用25nM和100nM的Paclitaxel持续刺激OVCAR3肿瘤细胞，在用药后的1，7，14，21天后，用荧光定量PCR技术检测其ST6GAL1表达水平的变化。用100nM的paclitaxel分别处理MDA-MB-435、Hela、PM8910等细胞24个小时后，检测各组细胞的ST6GAL1 mRNA的表达情况。 3、构建ST6GAL1基因的sh-RNAi干扰载体，利用Lipofectamine2000转染MDA-MB-435细胞。 4、用细胞损伤愈合实验检测转染后各组细胞的迁移能力。待细胞密度大于95%时，用200μl的枪头划板，检测转染后各组细胞在划板后24，48小时的愈合率。 5、检测转染后各组细胞对collagenⅣ和fibronectin的粘附力。 6、检测转染后各组细胞对paclitaxel细胞毒性的敏感性。 7、检测转染后各组细胞对paclitaxel诱导细胞凋亡率的变化。 8、转染后各组细胞与ECM的粘附后，对paclitaxel细胞毒性的抵抗作用。 9、转染后各组细胞与ECM的粘附后对paclitaxel诱导细胞凋亡的抵抗作用。 10、通过考察各组细胞的ST6GAL1、k-ras、paxillin、p-paxillin、FAK、p-FAK的蛋白水平的表达，初步探讨下调肿瘤细胞ST6GAL1表达对促进paclitaxel敏感性的分子机制。 结果: 1、MDA-MB-435的ST6GAL1 mRNA表达水平最高，而Hela和PM8910则居中；而OVCAR3细胞则最低，OVCAR3与其他各组细胞的ST6GAL1 mRNA表达水平相比均有显著性的统计学差异(P<0.001)。 2、OVCAR3细胞的ST6GAL1 mRNA表达水平与paclitaxel作用时间成正相关；与未加药组相比，OVCAR3细胞的ST6GAL1 mRNA表达水平被上调，而MDA-MB-435、Hela、PM8910细胞的ST6GAL1 mRNA表达水平均被下调。 3、sh-ST6GAL1细胞的ST6GAL1 mRNA表达水平明显低于MDA-MB-435细胞(P<0.05)和Sc-Vector细胞(P<0.05)；且在蛋白表达水平也明显低于MDA-MB-435细胞(P<0.001)和Sc-Vector细胞(P<0.01)，都具有统计学意义。MDA-MB-435细胞与Sc-Vector细胞相比，在ST6GAL1 mRNA水平(P>0.05)和蛋白水平(P>0.0S)均无统计学意义。 4、在24小时后，sh-ST6GAL1细胞的愈合率最低，且与MDA-MB-435细胞相比有统计学意义(P<0.05)，但与Sc-Vector细胞相比无统计学意义(P>0.05)；在48小时后，sh-ST6GAL1细胞的愈合率明显低于MDA-MB-435细胞(P<0.01)和Sc-Vector细胞(P<0.05)。 5、ECM(collagenⅣ或fibronectin)浓度与细胞和ECM粘附力成正相关，而sh-ST6GAL1细胞和ECM的粘附力最弱。 6、各组细胞的IC50值分别为：MDA-MB-435细胞(97nM)、Sc-Vector细胞(88nM)、sh-ST6GAL1细胞(44nM)，提示sh-ST6GAL1细胞对紫杉醇更加敏感 7、流式细胞仪定量各组细胞的凋亡率分别为：对照组：MDA-MB-435细胞(5.17%)、Sc-Vector细胞(6.41%)、sh-ST6GAL1细胞(7.02%)；紫杉醇药物处理24h后，MDA-MB-435细胞(27.44％)、Sc-Vector细胞(30.70％)、sh-ST6GAL1细胞(42.24%)。经紫杉醇处理后，各组细胞的凋亡率均明显增加(vs自身对照)，且在实验组中，sh-ST6GAL1细胞的凋亡率明显高于MDA-MB-435细胞(P<0.01)和Sc-Vector细胞(P<0.05)，都具有统计学意义。 8、与无ECM粘附作用相比，在collagenⅣ粘附组，paclitaxel对sh-ST6GAL1细胞的细胞毒性下降了25.65%，而在MDA-MB-435细胞和Sc-Vector细胞则分别下降了57.53%、56.56%，sh-ST6GAL1细胞细胞毒性下降差值明显低于MDA-MB-435细胞(P<0.001)和Sc-Vector细胞(P<0.001)，具有统计学意义。在fibronectin组，paclitaxel对sh-ST6GAL1细胞的细胞毒性差值下降了73.34％，而在MDA-MB-435细胞和Sc-Vector细胞则分别下降了88.58%、88.16%，sh-ST6GAL1细胞下降的细胞毒性同样明显低于MDA-MB-435细胞(P<0.001)和Sc-Vector细胞(P<0.001)，具有统计学意义。 9、与无ECM粘附相比，在collagenⅣ粘附组，paclitaxel诱导sh-ST6GAL1细胞的凋亡率下降了36.69%，而在MDA-MB-435细胞和Sc-Vector细胞则分别下降了51.86％、48.13%，sh-ST6GAL1细胞下降的凋亡率明显低于MDA-MB-435细胞(P<0.05)和Sc-Vector细胞(P<0.01)，具有统计学意义。在fibronectin组，paclitaxel诱导sh-ST6GAL1细胞的凋亡率下降了36.67％，而在MDA-MB-435细胞和Sc-Vector细胞则分别下降了50.60%、56.02%，sh-ST6GAL1细胞下降的凋亡率同样明显低于MDA-MB-435细胞(P<0.01)和Sc-Vector细胞(P<0.001)，具有统计学意义。 10、用紫杉醇处理后，各组细胞ST6GAL1的表达均有一定程度降低，在sh-ST6GAL1处理组下降更为显著。 11、ST6Gal1被shRNA沉默后，k-ras的表达亦随之下调同时ST6下调后只发现在FAK和Paxillin的磷酸化水平发生了改变，而非磷酸化的FAK和Paxillin的表达则没有显著性变化。 结论: (1)较低浓度的paclitaxel能下调高表达ST6GAL1肿瘤细胞的ST6GAL1 mRNA的表达，而上调低表达ST6GAL1肿瘤细胞的ST6GAL l mRNA的表达。肿瘤细胞与ECM的粘附可降低paclitaxel对乳腺癌细胞的杀伤作用。 (2)下调乳腺癌细胞ST6GAL1的表达后，可以抑制其细胞迁移的能力，降低其与ECM的粘附力，促进paclitaxel的杀伤作用。 (3)Paclitaxel可下调乳腺癌细胞ST6GAL1mRNA水平和蛋白水平的表达。另外，shRNAi联合Paclitaxel可显著抑制k-ras的表达，进而抑制FAK和Paxillin的活化而增强Paclitaxel对乳腺癌细胞的凋亡诱导作用。