苹果炭疽菌分子鉴定和检测及其致病性分子变异初步研究

摘要

rDNA核苷酸序列相似性最常用于真菌的分类和鉴定,其中ITS序列相对变异较大,已被用于多种炭疽菌的分类和鉴定。为进一步明确苹果炭疽菌分类地位,提高其检测效率和对苹果炭疽病进行早期诊断,本研究对苹果炭疽菌进行分子鉴定,并设计特异性引物用于苹果炭疽病的快速诊断。分子鉴定确定苹果炭疽菌应属于胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。本研究还在物理诱变筛选苹果炭疽菌低毒性菌株的基础上,运用RAPD和ISSR分子标记技术初步研究了苹果炭疽菌低毒性菌株的分子变异。 本研究首先利用引物CgF/CgR克隆了苹果炭疽菌rDNA片段并测序,rDNA核苷酸序列全长3156 bp。截取苹果炭疽菌rDNA的ITS序列,与其它炭疽菌ITS序列进行核苷酸序列比对,发现苹果炭疽菌与胶孢炭疽菌的ITS序列相似性高达99.8％。构建苹果炭疽菌与其它炭疽菌ITS序列的系统关系树,发现苹果炭疽菌与胶孢炭疽菌单独聚成一个分支,因此,可以明确苹果炭疽菌应属于胶孢炭疽菌。进一步的序列比对发现,苹果炭疽菌的18S rDNA3’端比其它胶孢炭疽菌多出一段379 bp的序列,根据这一特有片段设计引物CgF1与通用引物ITS4配对,结果仅能从苹果炭疽菌中扩增出1232 bp的特异性条带。用苹果炭疽菌接种离体苹果,以接种发病的病组织总DNA为模板,利用引物CgF1/ITS4进行PCR扩增,同样可以扩增出1232bp的特异性条带,而健康苹果组织DNA中未能扩增出任何条带,表明该方法可用于苹果炭疽菌的鉴定和快速检测。 利用引物CgF/CgR同样克隆了通过离子注入和磁场照射方法筛选出的苹果炭疽菌低毒菌株rDNA全序列,将诱变的低毒菌株rDNA克隆、测序,序列全长3156bp。序列比较发现,苹果炭疽菌诱变菌株rDNA和未诱变菌株序列只有1-2个核苷酸差异,相似性高达99.8％,几乎没有分子变异。 进一步利用RAPD和ISSR分子标记技术对苹果炭疽菌正常菌株和低毒菌株进行多态性扩增。实验筛选了30条RAPD随机引物,绝大多数随机引物不能扩增出丰富的多态性条带,只有随机引物C-9扩增条带较为丰富,但扩增的多态性条带完全相同,不能表现出苹果炭疽菌及其系列诱变株之间序列多态性差异。20条ISSR引物几乎均能扩增出多条多态性片段,但扩增出的苹果炭疽菌及其系列诱变株多态性条带高度一致,菌株间仍未能发现分子标记的差异性。初步研究未能发现苹果炭疽菌低毒菌株的分子变异。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1炭疽菌属传统分类研究进展

1.1炭疽菌的分类研究

1.2炭疽菌属的分类的研究

1.3炭疽菌种的分类的研究

2炭疽菌属分子分类研究进展

2.1 rDNA序列差异分析

2.2随机扩增多态性DNA(RAPD)分析

2.3限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析

2.4 ISSR标记

3苹果炭疽病研究现状

3.1苹果炭疽病的发生和危害

3.2苹果炭疽菌的分类

3.3苹果炭疽菌致病性诱变研究

引言

材料与方法

1实验材料

1.1供试菌株

1.2克隆菌株和载体

1.3酶与试剂

1.4主要仪器设备

1.5供试培养基

1.6供试苹果

2实验方法

2.1菌体培养

2.2总DNA的提取

2.3 PCR反应

2.4 PCR产物纯化

2.5 DNA克隆技术

2.6 rDNA全序列扩增

2.7苹果炭疽菌的鉴定

2.8苹果炭疽菌的检测

2.9序列分析

2.10离子束注入的诱变

2.11磁场照射的诱变

2.12低毒菌株的筛选

2.13诱变菌株rDNA序列的克隆与测序

2.14 RAPD分析

2.15 ISSR扩增

结果与分析

1.苹果炭疽菌分子鉴定和检测

1.1 Cg-1、Cg-2 rDNA序列的克隆与测序

1.2苹果炭疽菌的鉴定

1.3苹果炭疽菌特异性片段的PCR扩增

1.4苹果炭疽菌的检测

2.苹果炭疽菌分子变异初步研究

2.1苹果炭疽菌诱变株rDNA序列的克隆与测序

2.2 RAPD扩增结果

2.3 ISSR扩增结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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