苦杏仁苷酶关键酶基因cDNA的克隆和表达

摘要

苦杏仁苷酶是粗酶制剂，包含β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGLu)和羟基腈裂解酶(Hydroxynitrile 1yase，HNLs)等，主要存在于杏、桃、李子、苹果等多种果实的种子中，现在一般也将其作为主要含植物BGLu等糖苷酶的一般名使用，是与植物香气和产氰现象密切相关的酶。产氰现象是植物体的一种自然防御现象，能够保护植物免受病原真菌和害虫的侵袭，这主要是因为植物体中BGLu和HNLs联合作用降解含氰糖苷产生有毒的氢氰酸所致。目前，发掘与作物品质和抗性相关的基因资源仍是作物育种学研究的一项重要任务，由于BGLu和HNLs的独特作用，其在作物育种学研究中的应用必将会受到越来越多的重视。前期研究结果表明，烟草中缺乏水解以醇系香气物质为苷元的糖苷酶，商品苦杏仁苷酶(商品名为：β-glucosidase from ahnond)能高效水解烟草糖苷产生醇系香气类物质，因此可将该酶基因转入烟草。一方面能使烟草表达产生相应的苦杏仁苷酶，水解糖苷类物质释放香气，提高烟草的香气品质；另一方面烟草在受到病原菌和害虫的侵袭时，通过该酶的作用，能够抑制烟草病原真菌的生长。 本研究采用原核表达系统pET-32a(+)载体和BL21trxB(DE3)菌株对茶树中两种BGLu基因cDNA(Glu Ⅰ和Glu Ⅱ)进行了表达，研究了不同诱导时间、不同诱导温度对这两种BGLu基因表达量的影响并测定了两者表达产物的活性。表达分析结果表明，诱导6h、25℃时，Glu Ⅰ在总蛋白中所占比例最高；诱导6h、37℃时，Glu Ⅱ在总蛋白中所占比例最高。活性测定结果表明，两种表达产物均能水解BGLu的通用底物对硝基苯酚β-葡萄糖苷(PNPG)，并且在相同的测定条件下，GluⅡ活性(0.310±0.03 U·mL<'-1>)比Glu Ⅰ活性(0.234±0.03 U·mL<'-1>)更高；薄层层析(Thin Layer Chromatography，TLC)测定结果表明，两者均能水解苯甲醇-β-葡萄糖苷和苯乙醇-β-葡萄糖苷，产生葡萄糖和相应的苷元；气相色谱(GasChromatography，GC)测定结果表明，两者对烟草糖苷均具有一定的水解活性。 通过将杏树不同器官中粗酶液与烟草糖苷进行酶促反应发现，杏仁中的粗酶液具有水解烟草糖苷的活性，杏叶中几乎没有活性；本研究分析了商品苦杏仁苷酶的主要够成，确定了这种酶是由HNLs和另外的蛋白组成；通过对商品苦杏仁苷酶进行肽指纹图谱分析(peptide mass fingerprint，PMF)，得到了其部分一级结构信息(氨基酸序列信息)，根据这些氨基酸序列信息设计了两对简并引物X<,1>和X<,2>，X<,3>和X<,4>，尝试从杏仁中克隆了HNLs基因cDNA。

目录

文摘

英文文摘

一文献综述

二引言

1研究内容

2研究意义

3技术路线

三茶树的两种B-葡萄糖苷酶因cDNA在大肠杆菌中的表达

1材料

2方法

2.1茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA的克隆

2.2表达载体构建

2.3工程菌株的诱导表达

2.4表达的融合蛋白的生物学活性分析

2.5两种蛋白的生物信息学分析

3结果和分析

3.1茶树叶片总RNA的提取鉴定

3.2两种茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA的克隆

3.3表达载体的构建

3.4 GLU Ⅰ和GLUⅡ cDNA在大肠杆菌中的表达

3.5融合蛋白的酶活力测定

3.6两种蛋白的生物信息学分析

4讨论

4.1茶树叶片总RNA的提取鉴定

4.2两种茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA的克隆

4.3两种茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA的原核表达

4.4融合蛋白的生物学活性分析

5小结

四商品苦杏仁苷酶基因CDNA的克隆

1材料

2方法

2.1杏树器官的酶活检测

2.2商品苦杏仁苷酶纯度分析

2.3商品苦杏仁苷酶基因cDNA的克隆

3结果和分析

3.1杏树器官的酶活检测

3.2商品苦杏仁苷酶纯度分析

3.3商品苦杏仁苷酶cDNA的克隆

4讨论

5小结

参考文献

致谢

附录

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