家兔全卵巢程序化和玻璃化冷冻方法效果的比较研究

摘要

目的：
　　 近年来，随着医学上诊断及治疗技术的提高，新的放化疗方案的应用使得癌症患者的生存率不断的提高，但在癌症患者年轻化和生存率提高的前提下，仍然存在一个重要的问题，放化疗对卵巢造成的不可逆损害，使得年轻女性出现卵巢早衰(POF)及生育能力严重受损，如何保存高治愈率年轻女性癌症患者的卵巢功能成为研究的热点。在目前保存女性生殖能力的方法中，卵巢组织片的冷冻保存和自体移植是一种较为成熟的方法，目前已经应用于临床，但因冻融卵巢组织片无法立即建立血供导致缺血缺氧损伤而引起大量卵泡的丢失，移植效率低下已成为全面开展该技术临床应用的阻碍之一。全卵巢冷冻保存和移植不失为一种较好的方法，理论上可以通过血管吻合立即恢复血液供应减少卵泡的丢失，是未来的一个研究方向。但全卵巢相对体积大，组成细胞成分复杂，比卵巢组织片冷冻保存更加难操作，进一步开展动物实验，优化全卵巢冷冻保存方法是有必要的。目前的研究中主要从冷冻保存的方法、冷冻保护剂的配伍、冷却速率及冷冻剂渗透方式等方面来优化全卵巢的冷冻模型，家兔全卵巢冷冻保存不失为一种常见的动物模型，但对其研究不多。故本实验中通过不同冷冻保护剂的配伍和兔全卵巢灌注模型，采用程序化冷冻和玻璃化冷冻保存后，对其冷冻保存效果进行比较研究，从而优选出适宜兔全卵巢冷冻保存的方法，为人全卵巢冷冻保存奠定实验基础。
　　 方法：
　　 卵巢灌注及冷冻:取13只日本大耳白兔共26个带血管蒂兔全卵巢，采用本课题组专利“微血管灌注装置”经卵巢动脉以1.3ml/min的速率灌注。(1)1个卵巢行明胶墨汁灌注后进行固定HE染色，以证实全卵巢灌注系统的成功建立。(2)实验分组（5个卵巢/组）:灌注冷冻保护液1.5M PROH+L-15+10％FBS(A组,1.5M DMSO+L-15+10％FBS(B组)30min;依次灌注玻璃化平衡液7.5％EG+7.5％PROH+L-15+20％FBS15 min，玻璃化冷冻15％ EG+15％ PROH+L-15+S15 min（C组）;依次灌注7.5％EG+7.5％DMSO+L-15+20％FBS15 min，15％EG+15％DMSO+L-15+S15 min(D组);新鲜组为对照组（F组）。A、B两组经程序化冷冻，C、D两组经玻璃化冷冻，置于液氮中至少保存1周，然后采用相同的速率及相对应的解融液灌注冷冻的兔全卵巢，将解融后的卵巢沿纵轴剪开，将整个卵巢切成4块。
　　 解融后指标检测:1/4个卵巢固定于4％多聚甲醛中，石蜡包埋、切片，HE染色后在光镜下进行形态学分析，观察卵泡形态及血管结构评估冻融损伤及TUNEL检测卵巢组织在冻融过程中产生的DNA断裂片段;1/4个卵巢切成大小约1*1*1mm3小块电镜包埋处理，透射电镜下观察卵母细胞、卵泡细胞、颗粒细胞及线粒体等结构，比较各组卵巢组织超微结构的变化;1/4个卵巢行卵泡活力测试，经酶结合机械分离卵泡后细胞活性鉴别染液(20ul Ethidium homodimer-1+5ul calcein AM+10ml D-PBS)，荧光显微镜下观察并计数（活的细胞为绿色荧光，死的细胞为红色荧光），于共聚焦显微镜下拍照;1/8个卵巢行乳酸脱氢酶(LDH)定量检测其冷冻损伤程度;另余1/8置于液氮中保存。另取家兔全卵巢切成4块分别检测各指标作为新鲜对照组。
　　 结果：
　　 1.兔全卵巢墨汁灌注模型的建立；
　　 经明胶墨汁灌注后行HE染色的卵巢组织切片中可见墨汁已从卵巢门血管进入卵巢内部的血管，表明兔全卵巢灌注系统的成功建立。
　　 2.程序化慢冻和玻璃化冷冻方法对兔全卵巢卵泡及血管的组织形态学的影响；
　　 1)经HE染色观察四组冻融的兔卵巢组织及新鲜对照组中卵泡的形态结构发现:各组均有保存完好的各级卵泡及异常卵泡，异常卵泡主要表现为卵母细胞核深染，胞浆减少，皱缩等异常表现，各组卵泡形态正常率分别为F组90.42±1.60％、A组61.75±3.37％、B组76.62±6.24％、C组31.16±3.12％、D组28.74±6.44％，各组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，但C组与D组比较无显著性差异（P＞0.05）。
　　 2)光镜观察各组卵巢动静脉的形态:卵巢中段及末段-近卵巢门处动脉内皮及内弹性模结构完整，卵巢动脉起始段插管处可见内皮细胞脱落，内弹性模亦可见断裂，卵巢静脉各段未见明显静脉内皮细胞脱落，可见冻融对静脉的影响较动脉小。不同冷冻方法对各组兔全卵巢血管蒂的影响相差不大。
　　 3.TUNEL检测不同冷冻方法对兔卵泡凋亡的影响；
　　 通过荧光显微镜观察我们发现，黄绿色的荧光信号（为阳性信号）主要位于卵巢组织中的窦卵泡的颗粒细胞的细胞核中，其他类型的卵泡中少见。我们发现与F组比较，冻融四组凋亡指数(凋亡指数(AI)％=视野内的阳性细胞数/视野内总细胞数×10％）明显升高，差异具有统计学意义，凋亡指数分别为F组1.25±0.049％、A组2.62±0.098％、B组2.19±0.116％、C组5.71±0.135％、D组6.71±0.150％,(P＜0.05)。
　　 4.透射电镜观察不同冷冻方法对兔全卵巢卵泡超微结构的影响；
　　 冻融卵巢组织超微结构观察: A、B组，卵母细胞核内染色质较尚均匀，边界较清楚，形态较规则，核仁清楚，核膜间隙较规则，线粒体数量较新鲜组少但形态正常，空泡变性及肿胀少见，颗粒细胞间连接较好，核膜间隙规则，无增宽;C、D组卵母细胞形态不规则、边界不清楚，细胞质结构不一，且核膜周围线粒体明显减少，核膜间隙增宽不规则，颗粒细胞固缩，卵母细胞距颗粒细胞间距增宽，线粒体空泡变性，出现较多溶酶体，并且见线粒体肿胀推向边缘，高尔基体及内质网等细胞器形态不规则;F组，卵母细胞、颗粒细胞、线粒体及核膜等结构正常。
　　 5.细胞活性鉴别染色测试不同冷冻方法对兔全卵巢卵泡存活率的影响；
　　 荧光显微镜观察结果显示:死亡卵泡的百分比分别为A组27.95±2.18％、B组18.96±2.11％、C组56.53±1.99％、D组66.43±3.68％、F组8.01±1.63％，与F组比较，有显著性差异（P＜0.05）;A、B组与C、D组比较有显著性差异（P＜0.05）;A组与B组比较，有显著性差异（P＜0.05）;C组与D组比较，无统计学意义（P＞0.05）。
　　 6.乳酸脱氢酶(LDH)定量检测冻融卵巢组织冷冻损伤程度；
　　 检测LDH的活性比较各组卵巢组织的冷冻损伤情况，LDH的值分别为D组(2999.50±84.00 U/L)＞C组(2701.20±100.73 U/L)＞A组(1158.40±138.74U/L)＞B组(1067.20±56.00 U/L)＞F组(423.28±17.16 U/L)，F组明显低于冻融四组，有显著性差异(P＜0.05);A、B组与C、D组比较有显著性差异（P＜005）; A组与B组比较，无显著性差异(P＞0.05);C组与D组比较，有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1、兔全卵巢明胶墨汁灌注系统的成功建立，证明通过本课题组专利微血管灌注装置灌注冷冻保护剂进行兔全卵巢冷冻保存的实验是可行的。
　　 2、程序化冷冻和玻璃化冷冻过程均对兔卵巢卵泡具有一定的损伤，但程序化冷冻方法优于玻璃化冷冻方法，且程序化冷冻方法中以灌注30min1.5MDMSO+L-15+10％FBS(B组)方案效果相对较好，但是否为最适宜的冷冻方案仍需进一步的实验来完善和验证。

目录

摘要

前言

材料和方法

一、实验动物

二、主要试剂、仪器及试剂的配置

三、实验分组

四、实验步骤

五、指标检测

六、统计学处理

结果

1．卵巢血管灌注

2．卵泡及血管的形态学观察

3．TUNEL分析

4．电镜超微结构

5．卵泡分离及细胞活性鉴别染色

6．卵巢组织损伤

分析与讨论

结论

参考文献

附录：攻读硕士研究生期间完成的论文

致谢

综述 人卵巢组织冷冻和移植的研究进展

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