内质网应激反应在难免性压疮中的作用及细胞损伤信号通路研究

摘要

第一部分内质网分子伴侣蛋白在难免性压疮中的表达
　　 目的:观察内质网分子伴侣蛋白葡萄糖调节因子78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(caspase-12)在难免性压疮中不同阶段的动态变化，探讨难免性压疮与内质网应激(ERS)介导的细胞损伤的关系。
　　 方法:将40只雄性SD大鼠随机分为5组(n=8)即对照组，实验组分为1个周期组（1 c组），3个周期组（3 c组），6个周期组（6 c组），9个周期组(9 c组)。实验组采用特制的压力装置对受压部位进行施压，对照组未施压力。各组大鼠于实验终点给予安乐死。采用HE染色观察受压组织病理改变;SABC免疫组织化学法和western blot检测内质网分子伴侣蛋白GRP78，CHOP，caspase-12在受压肌组织不同时间点的动态变化;Hoechst染色检测肌细胞核凋亡情况。
　　 结果:
　　 (1) HE染色光镜下观察到，受压肌肉组织呈现逐渐退化的病理改变;受压皮肤组织仅表现为表皮变薄，在9c组出现真皮组织附属器的缺失;
　　 (2) SABC免疫组织化学法结果显示，不同时间点的GRP78，CHOP，caspase-12蛋白表达均高于对照组，棕黄色颗粒表达主要在胞浆和细胞核;
　　 (3) Western blot检测发现，GRP78蛋白表达总体呈上升趋势，表现为1c组表达不明显，3 c组达到峰值，6 c、9 c组下降，但仍高于对照组;CHOP蛋白表达呈上升趋势，1 c组表达显著，3 c组开始下降，但仍高于对照组，6 c组下降明显，9 c组再次升高;caspase-12蛋白表达也呈上升趋势，1 c组表达明显，3c组下降，6e组升高，9c组达到峰值;
　　 (4) Hoechst染色荧光显微镜观察发现，与对照组相比，受压组织细胞核凋亡程度呈上升趋势，差异有统计学意义。
　　 结论：
　　 (1)压疮首先起始于皮下深部组织损伤;(2)内质网应激(ERS)参与了难免性压疮损伤过程;(3)早期ERS通过诱导GRP78、CHOP、caspapse-12蛋白的表达在难免性压疮损伤过程中的起细胞保护性作用;(4) CHOP、caspase-12蛋白在受压组织中过表达，表明严重的ERS参与了受压组织细胞凋亡的病理过程，难免性压疮可能与ERS介导的细胞损伤有关，这可能是导致压疮难以预防及愈合的重要原因。
　　 第二部分探讨内质网应激参与难免性压疮的细胞分子信号通路
　　 目的：分析内质网伴侣蛋白及Akt、GSK3β及其磷酸化程度在难免性压疮损伤中不同阶段（实验组和恢复组）的表达变化，探讨ERS参与难免性压疮的细胞分子信号通路。
　　 方法：将54只雄性SD大鼠随机分为9组(n=6)即对照组，实验组又分为1个周期组（1 c组），3个周期组（3 c组），6个周期组（6 c组），9个周期组(9 c组)，完全解除压力后恢复组分为1天组(1d)，3天组(3d)，5天组(5d)，7天组(7d)，各组大鼠于实验终点给予安乐死。采用HE染色，观察受压组织在实验组和恢复组不同阶段的病理改变;Western blot检测受压组织中GRP78、CHOP、caspase-12及蛋白Akt、GSK3β、p-Akt、p-GSK3β在实验组和恢复组不同阶段的动态变化。
　　 结果：
　　 (1) HE染色光镜下观察发现，受压肌肉组织呈现逐步退化的过程，在恢复组，初期坏死区域炎性细胞大量聚集，随时间延长炎性细胞逐渐减少，但还存在大量的肌纤维紊乱、断裂，坏死碎片等病理现象;
　　 (2) Western blot检测受压组织中伴侣蛋白GRP78、CHOP、caspase-12发现，蛋白GRP78表达总体上呈上升趋势，3c组出现第一次峰值，之后略有下降，在恢复组第1d GRP78表达显著，第5d出现第二次峰值，第7d开始下降，但仍高于正常组;CHOP蛋白的表达总体呈上升趋势，1c组表达显著，之后略有下降，9c组出现第一次高峰，恢复组第1d，3d CHOP蛋白表达下降，第5d表达又开始上升，第7d表达达高峰;caspase-12蛋白表达也呈上升趋势，6c组表达显著，9c组出现第一次峰值，恢复组第1d，3d持续高表达，之后略有下降，但仍明显高于正常组。
　　 (3) Western blot检测发现，p-Akt蛋白表达呈先上升后逐渐下降的趋势，1c组，表达显著升高，3c，6c组下降，9c组蛋白表达下降最为明显，恢复组p-Akt蛋白表达呈先上升后下降的趋势，表现为第1d表达开始增加，第3d表达呈现第一次高峰，随后略有下降;p-GSK3β蛋白表达呈先上升后下降的趋势，1c组，3c组表达开始升高，6c组表达开始下降，9c组表达下降最为明显，在恢复组p-GSK3β蛋白表达呈先下降后上升趋势，表现为与9c组相比，第1d略有下降，第3d下降明显，第5d表达开始增加，第7d表达出现高峰。
　　 结论：
　　 (1)难免性压疮难以愈合的原因可能与深部组织肌肉损伤存在密切的联系;
　　 (2) ERS介导的细胞损伤参与了难免性压疮损伤过程;(3) PI3K/Akt信号通路可能参与了难免性压疮损伤进程，要明确是否通过此信号途径有待进一步的研究。(4)随着循环周期的延长，PI3K/Akt信号通路下游蛋白分子p-GSK3β表达减少，揭示在难免性压疮可能存在ERS和线粒体功能紊乱的交互作用。

目录

缩略语表

摘要

前言

1 研究背景和意义

2 国内外研究现状

3 技术路线

第一部分 内质网分子伴侣蛋白在难免性压疮损伤中表达

材料与方法

1 实验动物

2 实验仪器

3 试剂

4 动物模型

5 统计学方法

结果

1 HE染色观察肌肉组织形态学改变

2 HE染色观察皮肤组织形态学改变

3 受压肌肉组织的GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表达

4 Western blot检测组织内质网应激相关蛋白的表达

5 Hoechst染色观察肌细胞核凋亡情况

分析与讨论

研究二 探讨内质网应激参与难免性压疮的细胞分子信号通路

材料与方法

1 实验动物

2 实验仪器

3 试剂

4 动物模型

5 统计学方法

结果

1 HE染色观察实验组和恢复组中肌肉形态学变化

2 Western blot检测内质网应激相关蛋白的表达

3 Western blot检测Akt，GSK3 β蛋白的磷酸化程度

分析与讨论

小结

参考文献

本研究创新性

1 方法创新

2 技术创新

3 理论创新

有待解决的问题及今后研究的方向

附录

在校期间发表论文

致谢

综述 压疮早期深部组织损伤的研究进展

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