转基因水稻中外源基因表达特异性研究及CpTI蛋白细胞内定位研究

摘要

本研究对转sck基因水稻不同生长阶段、不同组织部位在转录、转译水平表达特异性进行研究，并且对转sck基因水稻中目的基因和标记基因所表达蛋白的暴露量进行评估，为下一步的急性毒性评估和致敏性评估奠定基础。本研究主要分为两个部分，一是探讨外源基因在高代转基因水稻中表达的特异性；二是CpTI蛋白的细胞内定位研究。
　　 ㈠转sck基因水稻外源基因表达特异性。
　　 为了研究转sck基因水稻中外源基因表达特异性和表达量，我们在转基因水稻T6代生长的不同时期随机取样，并且在转基因水稻幼苗期、分蘖期、幼穗发育期、灌浆结实期等生长时期植株的不同组织部位对目的基因sck和标记基因hpt在转录、转译水平的表达特异性和表达量进行了分析测定。
　　 PCR和Southern杂交结果显示，转基因水稻中两种外源基因sck和hpt已整合到寄主植物水稻基因组中，稳定遗传到T6代，没有发生基因沉默或丢失。
　　 我们用Northern杂交对sck和hpt基因在转录水平的表达进行分析。Northern杂交结果表明，转基因水稻植株的叶片、茎杆、根部和乳熟期种子中的sck基因均在转录水平上获得表达，并且在分蘖期、幼穗发育期、灌浆结实期的叶片中的表达量均明显高于同时期的其他组织;在各个生长时期的转基因水稻叶片中，sck基因转录水平均有表达，表达量在分蘖期、幼穗发育期、灌浆结实期差别不大，但是在幼苗期的表达量明显低于其它时期。hpt基因在各个生长时期的叶片中转录水平表达量都比较低，并且各个时期之间的差别不大。
　　 对外源基因蛋白水平表达的研究，我们采用了Western blot杂交、ELISA法和蛋白酶抑制剂测定法。Western杂交结果表明，CpTI蛋白和IIPT蛋白在水稻的根部、茎部和叶片中均有表达，并表现出与大肠杆菌中表达的标准蛋白相同的免疫原性，而成熟并在4℃贮存两个月的种子中和非转基因对照的叶片中没有被检出。
　　 CpTI蛋白ELISA检测结果显示，CpTI蛋白在幼苗期、分蘖期、幼穗发育期、灌浆结实期的叶片、茎部、根部均有表达，叶片中CpTI蛋白的含量最高，但是由于茎部和根部的总蛋白含量仅为叶片可溶性总蛋白含量的1/5-1/2，所以茎部和根部的CpTI蛋白与可溶性总蛋白的比值相对较高。在分蘖期、幼穗发育期、灌浆结实期叶片中，CpTI蛋白平均占总蛋白的0.19％，幼苗期的叶片中CpTI蛋白表达量仅占总蛋白的0.04％。在茎杆中CpTI蛋白平均占总蛋白的0.53％，根部组织中CpTI蛋白平均占总蛋白的0.62％。。以上结果与Northern杂交结果较为一致。在成熟的种子中CpTI蛋白含量低于检测低限(＜0.014μg/ml)，不能被定量。由此可见，CpTI蛋白已经能在转sck基因水稻T6代的不同生长时期的营养生长组织中稳定表达，具有全程抗性，能有效的发挥抗虫作用。
　　 HPT蛋白ELISA检测结果显示，HPT蛋白在幼苗期、分蘖期、幼穗发育期、灌浆结实期的叶片中均有表达，不同生长发育时期表达量没有差异。叶片中HPT蛋白平均占总蛋白的0.085‰，明显低于叶片中CpTI蛋白的表达量(0.19％)。我们还检测了转基因水稻灌浆结实期不同营养生长组织中HPT蛋白的表达量，茎部和根部HPT蛋白表达量较低，但是由于茎部和根部的可溶性总蛋白含量仅为叶片可溶性总蛋白含量的1/5-1/2，所以茎部和根部的HPT蛋白与可溶性总蛋白的比值相对较高。茎杆中HPT蛋白平均占总蛋白的0.15‰，根部组织中HPT蛋白平均占总蛋白的0.19‰。。种子中HPT蛋白的含量不超过负对照，不能被检测。
　　 胰蛋白酶抑制剂活性测定结果表明，转基因水稻叶片提取蛋白的胰蛋白酶抑制剂活力的高于非转基因对照水稻，说明转基因水稻叶片提取蛋白中所含胰蛋白酶抑制剂含量高于同种非转基因对照水稻。转基因和非转基因水稻种子提取蛋白中胰蛋白酶抑制剂活力相差不明显，说明在转基因水稻与非转基因水稻种子中胰蛋白酶含量差异不大。以上检测结果与ELISA的检测结果基本一致。
　　 ㈡CpTI蛋白的细胞内定位研究。
　　 本研究通过透射电镜、激光扫描共聚焦显微镜，运用免疫组织化学方法，观察在转基因水稻细胞中CpTI蛋白的定位情况。用低熔点多酯蜡Steedman's wax对水稻叶片材料进行包埋，切片后用激光共聚焦荧光显微镜观察，结果可见，在转基因水稻的叶片细胞中绿色荧光主要分布在转基因水稻的叶片细胞边缘，有的是沿细胞膜分布一圈，有的是沿细胞膜分布半圈，有的分散分布在几处。可见CpTI蛋白存在于转基因水稻的叶片细胞中，并且主要沿细胞膜分布。在同种非转基因对照水稻叶片的切片中几乎看不到绿色荧光的存在，说明无CpTI蛋白的存在。
　　 我们用免疫电镜技术对CpTI蛋白进行了进一步的亚细胞结构定位。用单克隆抗体与超薄切片中的抗原相结合，再选用胶体金标记的羊抗小鼠IgG为二抗，与抗原-抗体复合物结合，在透射电镜下观察胶体金颗粒所在位置，即为抗原抗体反应部位。观察结果可见，在转sck基因水稻根尖部细胞的内质网中和内质网附近有胶体金颗粒大量存在，细胞的质体、叶绿体、细胞质、细胞核中也散在一些胶体金颗粒，可以推论，转sck基因水稻中的CpTI蛋白在内质网中大量存在，在其他亚细胞器也呈散在分布。在非转基因对照水稻的根尖部内质网和其他亚细胞器中几乎未发现胶体金颗粒存在，说明非转基因水稻根尖部细胞中基本上没有CpTI蛋白。水稻叶片细胞中由于有液泡存在，内质网不明显，还不能明确观察到CpTI蛋白是否在内质网聚集，但是在细胞核、质体和细胞质内也发现少量胶体金颗粒散在分布，而非转基因水稻的叶片中几乎未发现胶体金颗粒，说明转基因水稻叶片细胞中也存在CpTI蛋白，而同种非转基因对照水稻的叶片细胞中基本上不存在CpTI蛋白。
　　 小结：
　　 ⑴转sck基因水稻中的外源基因sck和hpt已整合到寄主植物基因组中，稳定遗传到T6代。
　　 ⑵在转录水平，sck基因和hpt基因在生长时期全程的营养生长组织中均有表达。其中叶片的表达量均明显高于其他组织，幼苗期叶片的表达量明显低于其它时期叶片的表达量。
　　 ⑶在翻译水平，CpTI蛋白在各个生长时期的营养生长组织中均有表达，并且具有胰蛋白酶抑制剂活性，以叶片中的表达量为最高，在成熟的种子中CpTI蛋白表达量低于检测低限(＜0.014μg/ml)，不能被定量。根据ELISA检测低限估计，城市CpTI蛋白的平均摄入量＜7.63μg/标准人/日，95％上限摄入量＜16.2μg/标准人/日；农村CpTI蛋白的平均摄入量＜9.96μg/标准人/日，95％上限摄入量＜18.6μg/标准人/日。
　　 ⑷在翻译水平，HPT蛋白在各个生长时期的营养生长组织中均有表达，但是表达量明显偏低，种子中HPT蛋白的表达量不超过负对照，不能被检测。根据 Western blot标准蛋白的上样量估计，城市HPT蛋白的平均摄入量＜5.89μg/标准人/日，95％上限摄入量为12.5μg/标准人/日;农村HPT蛋白的平均摄入量＜7.45μg/标准人/日，95％上限摄入量为14.3μg/标准人/日。
　　 ⑸转sck基因水稻叶片和根部细胞中均存在CpTI蛋白，并且CpTI蛋白在内质网有一定程度的聚集，但在其他亚细胞器也呈散在分布。转sck基因水稻通过对 cpti基因的修饰，已经基本上成功地将大部分CpTI蛋白定位到靶器官——内质网。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

前言

第一章转sck基因水稻中外源基因表达特异性

第一节材料和方法

第二节结果

第三节讨论

结论

第二章CpTI蛋白的细胞内定位研究

第一节材料与方法

第二节结果与讨论

结论

综述Ⅰ：转基因食物生物安全性评价研究进展

综述Ⅱ：植物抗虫基因工程进展

附录

参考文献

博士在读期间发表文章

致谢