截短型KGF-1在杆状病毒表达系统中的表达及其生物活性研究

摘要

目的:构建重组杆状病毒表达载体Bacmid-kgf1，完成杆状病毒的传代，扩大病毒滴度。完成KGF-1在sf9细胞中的正确表达，初步确定表达的最佳条件。纯化得到高纯度蛋白，通过BaF3细胞及小鼠毛囊实验鉴定重组蛋白的生物学活性。
　　 方法:利用PCR扩增截短型角质细胞生长因子-1基因序列(kgf1)，将其克隆到pFastBac杆状病毒转移载体上转化DH10Bac感受态细胞，这种感受态细胞中含有经过改造的杆状病毒载体Bacmid，通过转座子原理将kgf1重组到杆状病毒载体上，完成Bacmid-kgf1的构建。运用蓝白斑重复筛选的办法挑选出高纯度阳性质粒。使用转染试剂盒侵染昆虫细胞，通过重复转染完成病毒的传代扩大病毒滴度。并通过蚀斑法来计算病毒滴度大小，确定病毒的感染能力。为了提高蛋白产量，对蛋白表达最佳条件进行了初步探索，首先在确定MOI条件下转染处于对数生长期的sf9细胞，每隔24h，即24，36，48，60，72，84，96，108，120h时收获蛋白样品运用Western Blot方法进行鉴定确定最佳TOI;再取五瓶生长状态一致的sf9细胞，设定MOI为1，2，4，8，16，同时转染细胞并同时收获样品Western Blot方法进行鉴定确定最佳MOI。按照得出的最佳表达条件，对蛋白进行扩大生产。由于重组蛋白生物学活性的鉴定对蛋白的纯度要求严格，所以本实验对收获的蛋白样品进行了纯化。运用KGF-1能够特异性结合肝素的性质，纯化第一步使用肝素亲和柱进行分离，第二步使用阳离子交换柱进行分离。纯化结果通过HPLC鉴定。KGF-1的生物学活性通过细胞实验和动物实验来测定:培养BaF3细胞，用基础培养基对KGF-1进行二倍梯度稀释分别作用于细胞，设定起始浓度为100ng/ml，终止浓度为0.1 ng/ml，48h后运用MTT的方法检测促增殖效果;动物实验，选24只6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为三组，昆虫KGF-1给药组、原核KGF-1给药组和生理盐水组。给药组每天按照1mg/kg剂量皮下给药一次，生理盐水组同样方法注射生理盐水，连续三天。第四天对小鼠背部进行剃毛处理，每天观察毛囊生长情况，并分别于第九天和第十八天处死部分小鼠，取皮肤进行HE染色，观察毛囊形态。
　　 结果:载体构建部分，PCR鉴定以及基因测序结果表明Bacmid-kgf1构建成功。转染发生72h后发现，被病毒转染的sf9细胞与正常细胞相比更大、更圆并且出现颗粒状物，证明病毒转染成功。收获蛋白样品的SDS-PAGE以及Western Blot结果表明，分子量约17kDa的KGF-1在昆虫细胞中实现了表达。表达优化条件的初步探索显示，目的蛋白在病毒侵染细胞48 h时开始表达，到96 h时表达量达到最高，超过96h蛋白量又有下降趋势;且MOI为4时表达量较好。蛋白纯化过程中，样品经肝素亲和柱后，目的蛋白被含有0.6M NaCl的50mM PB洗脱下来，经过除盐处理后进行第二步纯化，KGF-1存在于含有0.6M NaCl的50mM PB洗脱液中。HPLC结果显示在相同洗脱条件下，目的蛋白的保留时间与阳性对照品基本相同，可见得到的蛋白纯品确定为KGF-1，蛋白纯度达到95％。Bradford蛋白浓度测定经过纯化之后蛋白产量，约2 mg/L。细胞活性测定结果可见，KGF-１对转染FGFR2Ⅲb的BaF3细胞有显著的促增殖活性，在0.1ng/ml-1.6 ng/ml呈剂量依赖关系，促细胞增殖活性优于原核KGF-1加药组。小鼠毛囊实验中，KGF-1处理组与阴性对照组相比小鼠背部皮肤变黑时间明显缩短，与原核KGF-1给药组组效果相当。
　　 结论:具有显著生物学活性的、大小约17kDa的KGF-1在IC-BEVS中成功表达，经过肝素亲和柱以及阳离子交换柱纯化之后，蛋白纯度达到95％。

目录

缩略词表

摘要

前言

第一部分 重组杆状病毒载体Bacmid-kgf1的构建

1 引言

2 实验仪器与材料

3 方法

3．1 设计引物PCR扩增kgf1基因片段

3．2 PCR反应产物的切胶回收

3．3 中间载体T-kgf1的制备

3．4 转移载体pFastBac-kgf1的制备

3．5 穿梭载体Bacmid-kgf1的制备

4 实验结果

4．1 PCR扩增kgf1基因

4．2 中间载体T-kgf1质粒的菌液PCR鉴定

4．3 中间载体T-kgf1的体PstⅠ、NotⅠ双酶切反应

4．4 pFastBac载体的PstⅠ、NotⅠ双酶切反应

4．5 转移载体pFastBac-kgf1的菌液PCR鉴定

4．6 转移载体pFastBae-kgf1的PstⅠ、NotⅠ双酶切鉴定

4．7 穿梭载体Baemid-kgf1的菌液PCR鉴定

5 分析与讨论

第二部分 KGF-1在sf9细胞中的表达及纯化

1 引言

2 实验仪器与材料

3 方法

3．1 sf9昆虫细胞的培养

3．2 Bacmid-kgf1转染昆虫细胞

3．3 收获病毒

3．4 病毒滴度的测定

3．5 蛋白表达条件初步优化

3．6 KGF-1蛋白的纯化

3．7 KGF-1的HPLC鉴定

4 实验结果

4．1 正常及感染病毒之后的sf9昆虫细胞

4．2 昆虫细胞生长状态随病毒侵染时间的变化

4．3 KGF-1表达条件初步优化

4．4 KGF-1蛋白的纯化

4．5 KGF-1的HPLC鉴定

5 分析与讨论

第三部分：KGF-1的生物学活性研究

1 引言

2 实验仪器与材料

3 方法

3．1 KGF-1促细胞增殖活性测定

3．2 KGF-1促毛囊生长活性测定

4 实验结果

4．1 MTT法检测KGF-1促细胞增殖活性

4．2 KGF-1促进小鼠毛囊生长研究

5 分析与讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢

综述 昆虫杆状病毒表达载体系统的发展及其应用

声明