腺苷受体介导的cAMP信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中的作用

摘要

肝脏是人体消化系统中最大的消化腺，亦是最主要的药物代谢器官，对来自体内和体外的很多非营养物质如药物、毒物以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用。在药物使用过程中，因药物或其代谢产物引起的肝组织的生理功能变化或免疫应答所引起的肝损伤称为药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)。　　对乙酰氨基酚（别名扑热息痛，Acetaminophen，APAP），是目前应用最广泛的解热镇痛药，但该药过量使用可引起肝细胞毒性，导致肝脏损伤。对乙酰氨基酚已在临床广泛使用，但如何合理抑制其肝毒性尚无良策。作为内源性嘌呤核苷的腺苷（adenosine）和腺苷受体（adenosine receptors，ARs）在很多疾病的发生发展过程中起到重要作用。其中，腺苷受体广泛存在于肝细胞，在肝脏疾病的发病机制中发挥重要作用，但其在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤机制中的作用尚未见报道。Chan等研究表明，当甲氨蝶呤等药物刺激肝细胞时，腺苷释放量会增加，腺苷受体通过介导cAMP-PKA信号通路参与肝脏炎症的发生。Alchera等研究表明，腺苷增加导致肝细胞缺氧，炎症，急性损伤，而过量的对乙酰氨基酚也造成肝细胞损伤。　　由此推测，在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤过程中，对乙酰氨基酚通过激活ARs而引起肝细胞损伤，cAMP-PKA信号通路也参与其中。该实验拟通过以对乙酰氨基酚灌胃制作药物性肝损伤模型，探讨ARs及其介导的cAMP-PKA信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中的作用。主要内容概括如下：　　1.对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型的建立　　将50只雄性昆明种小鼠随机分为空白对照组和模型组。模型组给予对乙酰氨基酚500 mg/kg，空白对照组给予等量的生理盐水，两组均为单次灌胃给药。24 h后分别于空白对照组和模型组中各取10只小鼠，检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆汁酸（TBA）水平，HE染色观察肝脏病理变化；剩余小鼠用于肝细胞提取。　　2.腺苷受体调节剂对对乙酰氨基酚致药物性肝损伤整体模型的影响　　将160只雄性昆明种小鼠随机分为空白对照组、模型组、CPA组、DPCPX组、CPA＋DPCPX组、CGS组、ZM241385组、CGS组＋ZM241385组，参考文献方法，分别给予0.9﹪的氯化钠注射液500 mg/kg、对乙酰氨基酚500 mg/kg（生理盐水配制），各组均为单次灌胃给药。然后分别给予CPA组、DPCPX组、CPA＋DPCPX组、CGS组、ZM241385组、CGS组＋ZM241385组：CPA(0.05mg/kg，ip)，DPCPX(0.1 mg/kg)，CPA＋DPCPX，CGS21680(0.2 mg/kg，i.p.)，ZM241385(0.1 mg/kg)，CGS21680＋ZM241385。24 h后分别于每组中各取10只小鼠，眼眶取血并剖腹取肝，留取标本观察肝脏生化指标和组织病理学改变；剩余小鼠用于肝细胞提取。　　3.肝细胞的分离、培养与鉴定　　将雄性昆明种小鼠(40-60g)用10％水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，酒精消毒其腹部皮肤。打开小鼠腹腔，将内脏拨到右边，使门静脉暴露并用静脉注射器插入门静脉。用在37 oC水浴中预热过的EGTA溶液、0.075%I型胶原酶液依次灌注肝脏。待肝脏变为土黄色后进行分离并切割，加D-hanks使成肝组织液与0.075%I型胶原酶液。在室温下将混合液摇动15min后过滤并离心，分离肝细胞。将肝细胞置于加有DMEM(含25%胎牛血清)的培养皿中培养，48h更换培养液。结果显示，肝细胞得率为1×109个/肝，肝细胞存活率为95%。　　4.腺苷受体在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中的表达　　由前期研究可知，对乙酰氨基酚在500 mg/kg，作用24 h时，药物性肝损伤最为明显。因此我们选之作为对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型的造模条件，并同时设空白对照组，选用实时定量PCR法及Western blot法检测肝细胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R表达水平。结果显示，在正常肝细胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R均有表达；在500 mg/kg对乙酰氨基酚作用24 h后，对乙酰氨基酚模型组与正常组比较，腺苷A1R和A2AR的表达水平明显增高，A3R、A2BR表达未见明显变化。结果表明，对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型及正常小鼠分离的肝细胞均表达腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R，且A1R、A2AR在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型组表达明显增高。　　5.对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中腺苷A1R介导的cAMP信号通路的作用　　以1×105个/ml密度将肝细胞均匀接种于6孔板中，于24h后随机分组进行实验。实验设空白对照组，模型组，PTX（Gi/o蛋白耦联受体抑制剂）组，NECA（非选择性ARs激动剂）组，NECA与PTX联合用药组。除正常对照组外其余各组肝细胞均取自以500mg/kg对乙酰氨基酚作用24h的小鼠。分别给予PTX组及NECA与PTX联合用药组肝细胞100ng/ml PTX进行刺激，24h后再给予NECA组及NECA与PTX联合用药组肝细胞以10μM NECA进行刺激，采用ELISA法于10min后检测肝细胞内cAMP含量，Western blot法对PKA及磷酸化CREB在蛋白水平上的表达进行检测。结果表明，模型组cAMP含量较正常组明显升高；PKA、磷酸化CREB蛋白的表达较正常组明显升高，在PTX，NECA刺激肝细胞后，模型组cAMP，PKA和磷酸化CREB蛋白的表达均进一步升高，且PTX刺激肝细胞后能显著增强NECA的作用。结果提示，AR-Gi/o-AC-cAMP信号通路存在于肝细胞中，Gi/o蛋白耦联受体抑制剂PTX通过抑制Gi/o-AC-cAMP通道，使非选择性ARs激动剂NECA通过A2AR-Gs-AC-cAMP通道促进cAMP生成作用进一步加强。　　为进一步研究对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中腺苷A1R及其介导的cAMP信号通路的作用，将肝细胞模型分别与1μM腺苷A1R激动剂CPA、10 nM腺苷A1R拮抗剂DPCPX、CPA与DPCPX联合用药组共同孵育48h。结果表明，经腺苷A1R激动剂CPA处理后，模型组肝细胞中cAMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表达明显下降。而在腺苷A1R拮抗剂DPCPX作用下，模型组cAMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表达水平进一步升高。同时，CPA与DPCPX合用后可使二者单独使用时产生的作用发生明显逆转。结果表明在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中A1R-Gi/o-AC-cAMP-PKA-CREB信号通路具有一定的作用。　　6.对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中腺苷A2AR介导的cAMP信号通路的作用　　以1×105个/ml密度将肝细胞接种于6孔板中，于24h后随机分组进行实验。实验设空白对照组，模型组，Rolipram（磷酸二酯酶(IV)抑制剂）组，NECA（非选择性ARs激动剂）组，NECA与PTX联合用药组。除正常对照组外其余各组肝细胞均取自以500mg/kg对乙酰氨基酚作用24h的小鼠。以10μM Rolipram刺激Rolipram组及NECA与Rolipram联合用药组肝细胞，15min后再以10μM NECA刺激NECA组及NECA与Rolipram联合用药组肝细胞，10min后ELISA法检测肝细胞内cAMP含量，Western blot法对PKA及磷酸化CREB在蛋白水平上的表达进行检测。结果表明，模型组cAMP含量较正常组明显升高；PKA、磷酸化CREB蛋白的表达较正常组明显升高，模型组cAMP含量以及PKA和磷酸化CREB蛋白的表达在Rolipram和NECA作用下均能进一步升高。普遍认为主要有两条途径可升高细胞内cAMP含量：一是抑制细胞内磷酸二酯酶活性，二是激动腺苷受体；研究表明，磷酸二酯酶(IV)抑制剂Rolipram和非选择性AR激动剂NECA均能够使cAMP含量显著增加。　　为研究对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中腺苷A2AR及其介导的cAMP信号通路的作用，将肝细胞模型分别与1μM腺苷A2AR激动剂CGS21680、1μM腺苷A2AR拮抗剂ZM241385、CGS21680与ZM241385联合用药组共同孵育48h。结果表明，肝细胞经腺苷A2AR拮抗剂ZM241385处理后，模型组中cAMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表达明显下降。而在腺苷A2AR激动剂CGS21680作用下，模型组cAMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表达水平进一步升高。同时，ZM241385与CGS21680联合用药组可使二者单独使用时产生的作用发生明显逆转。结果证实在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中A2AR-Gs-AC-cAMP-PKA-CREB信号通路具有一定的作用。　　综上所述，在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中，腺苷A1R和A2AR表达水平均较正常肝细胞明显增强，腺苷A1R和A2AR共同参与调控对乙酰氨基酚致药物性肝损伤过程，腺苷A1R和A2AR拮抗剂在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中均具有显著的抑制作用，但两者对cAMP-PKA-CREB信号通路具有相反的调节作用。

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前言

1、实验材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 溶液配制1) D-Hanks:

1.4 仪器及设备

2 实验方法

2.1 对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型的建立

2. 2腺苷受体调节剂对对乙酰氨基酚致药物性肝损伤整体模型的影响

2. 3 样本收集与肝脏生化指标的检测

2.4 肝细胞的分离、培养与鉴定

2.5 实验分组

2.6 ELISA法检测cAMP含量

2.7 实时定量PCR法检测各组原代细胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R mRNA表达水平

2.8 Western blot法检测各组原代细胞中的A1R、A2AR、A2BR、A3、PKA、CREB蛋白的表达

2.9 Western bloting检测PKA，CREB蛋白表达

2.10 统计学分析

3、实验结果

3.1各组小鼠肝功能相关检测结果

3.2各组小鼠肝脏组织病理学检查结果

3.3腺苷受体调节剂对对乙酰氨基酚致药物性肝损伤整体模型的影响

3.3原代分离小鼠肝细胞的细胞形态

3.4 腺苷 A1，A2A，A3，A2b 受体在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中的表达情况

3.4 腺苷A1受体介导的cAMP信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中的作用

3.5 腺苷A2A受体介导的cAMP信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中的作用

4.讨论

5 结论

参考文献

附录个 人 简 历

致谢

综述:药物性肝损伤动物模型的制备和评价