4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对淋巴瘤细胞的诱导分化作用及其可能机制

摘要

全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)作为诱导分化剂的代表,已广泛应用于急性早幼粒性细胞白血病的临床治疗,其能诱导肿瘤细胞向正常或接近正常细胞方向分化,从而达到治愈肿瘤的目的,但同时也存在维甲酸综合征和耐药等不足。本实验室以 ATRA为先导化合物,通过对其碳链末端极性基团进行结构修饰,合成了一系列全新的维甲酸衍生物,经过体外药效学筛选发现4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)具有较强的诱导分化活性,有望开发成为一种新型的诱导分化剂。本研究以鼠淋巴母细胞瘤细胞株YAC-1和人套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1为研究对象,通过体外实验观察ATPR对淋巴瘤细胞分化的作用,并探讨其作用的可能机制。　　目的:观察新型维甲酸衍生物 ATPR对淋巴瘤细胞分化的影响,并探讨其作用的可能机制。　　内容:　　1.观察ATPR对YAC-1和Jeko-1细胞的诱导分化作用。　　2.观察ATPR对YAC-1和Jeko-1细胞中维甲酸受体表达的影响。　　3.探讨PTEN/PI3K/Akt通路在ATPR诱导YAC-1和Jeko-1细胞分化过程中的作用。　　方法:　　1.ATPR诱导分化作用的观察:MTT法观察ATPR对YAC-1和Jeko-1细胞增殖的影响;倒置显微镜下观察ATPR对YAC-1和Jeko-1细胞形态的影响;NBT还原试验法分析YAC-1和Jeko-1细胞的功能分化程度;同时,以Jeko-1细胞为研究对象,采用流式细胞仪测定细胞周期的变化及特异性分化指标CD38的表达变化。　　2.维甲酸受体的检测:RT-PCR和Western Blot法检测ATPR对YAC-1和Jeko-1细胞维甲酸受体mRNA表达和蛋白水平的影响。　　3.PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白的检测:采用Western Blot法检测ATPR引起的YAC-1细胞中PTEN/PI3K/Akt和cyclinD蛋白水平的变化。采用RNA干扰技术靶向技术沉默Jeko-1细胞PTEN基因,6h后加入ATPR及ATRA作用72h后采用Western Blot法观察pAkt和cyclinD蛋白水平的变化。　　结果:　　1.ATPR对YAC-1和Jeko-1细胞有诱导分化作用:MTT结果显示,ATPR能抑制YAC-1和Jeko-1细胞增殖;显微镜下观察,ATPR可诱导YAC-1和Jeko-1细胞形态呈分化改变;NBT阳性细胞百分比显著升高;在 Jeko-1细胞中,G0/G1期细胞比例上升,表面分化抗原CD38表达显著增加。　　2.ATPR通过和维甲酸受体结合发挥诱导分化的作用:ATPR引起YAC-1细胞中RARα的mRNA表达和蛋白水平升高,RARβ和RARγ mRNA表达和蛋白水平无明显变化;ATPR引起Jeko-1细胞中RARα和RARγ的mRNA表达和蛋白水平升高,而RARβmRNA表达和蛋白水平无明显变化。　　3.ATPR通过调节PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白发挥诱导分化的作用:ATPR在YAC-1细胞中可诱导PTEN蛋白表达升高,并下调p-Akt和cyclinD的蛋白表达;在Jeko-1细胞中,靶向沉默PTEN基因6h后加入ATPR及ATRA作用72 h发现,转染组、转染后加药组p-Akt和cyclinD蛋白表达量明显增高。　　结论:　　1.ATPR对YAC-1和Jeko-1细胞具有诱导分化作用。　　2.ATPR在YAC-1和Jeko-1细胞中通过和维甲酸受体结合,调节PTEN/PI3K/Akt通路发挥诱导分化的作用。

目录

封面

声明

目录

英 文 缩 略 词

中文摘要

英文摘要

1前言

2 实验材料

2.1 细胞株

2.2 药物与试剂

3 实验方法

3.1细胞培养

3.2 MTT法观察细胞增殖

3.3 细胞形态学观察

3.4 NBT还原实验

3.6 细胞表面分化抗原检测

3.7 RT-PCR技术检测YAC-1和Jeko-1细胞中RARs mRNA表达

3.8 Western blot 检测RARα，RARβ，RARγ蛋白的表达

3.9 Weston blot检测YAC-1细胞中PTEN、Akt、pAkt、cyclinD的表达

3.10 RNA干扰技术沉默Jeko-1细胞内PTEN基因

3.11 Western Blot检测PTEN沉默后Jeko-1细胞内Akt、pAkt、cyclinD的蛋白表达。

3.12 结果分析

4 结果

4.1 ATPR对YAC-1和Jeko-1细胞增殖的影响

4.2 ATPR对细胞形态学影响

4.3 ATPR对NBT还原率的影响

4.4 细胞周期及DNA倍体分析

4.5 细胞表面分化抗原CD38表达的改变

4.6 RARα、RARβ、RARγmRNA的表达变化

4.7 RARα、RARβ、RARγ 蛋白的表达变化

4.8 YAC-1细胞中 PTEN、Akt、pAkt、cyclinD蛋白的表达

4.9荧光法评价转染效率

4.10 不同沉默条件对siRNA-PTEN mRNA表达的影响

4.11 靶向沉默PTEN基因ATPR调节Jeko-1细胞内PI3K/Akt及cyclinD相关蛋白表达变化

5 讨论

5.1 ATPR对淋巴瘤YAC-1和Jeko-1的诱导分化作用

5.2 ATPR对维甲酸受体的影响

5.3 PTEN/PI3K/Akt 参与ATPR诱导YAC-1和Jeko-1细胞分化

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述