截断型人转化生长因子受体Ⅱ真核表达载体的构建和表达

摘要

肝纤维化在慢性肝病的病理生理过程中占重要地位，阻断其向肝硬化发展，促使其逆转具有重要意义，而转化生长因子β在该过程中起重要作用，本课题旨在利用现代分子生物学和基因工程技术构建一个没有胞内段的不能转导胞外信号的截断型人转化生长因子βⅡ型受体的表达载体，为进一步研究其生物学效应及在肝硬化中的作用奠定基础。 目的：构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体(△TβRⅡ)的真核表达载体pEGFP/△TβRⅡ，转染人胚肝细胞L02以表达融合蛋白EGFP/△TβRⅡ，并检测其胞外段的生物学活性。 方法：以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体(TβRⅡ)胞外段和跨膜段的cDNA，并在两端分别引入EcoRI和BamHI限制性内切酶位点，将该cDNA经EcoRI和BamHI双酶切、纯化回收后克隆到真核表达载体pEGFP-N2上，构建成pEGFP/△TβRⅡ重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定，将该重组质粒由脂质体Lipofectamin2000介导转染人胚肝细胞L02，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白EGFP的表达，加入G418筛选得到阳性克隆，并用四唑盐(MTT)比色法和流式细胞术(FCM)检测其生物学活性。 结果：①重组质粒pEGFP/△TβRⅡ经EcoRI和BamHI双酶切，得到两个阳性片断，其中小片段带与PCR产物条带在相同位置，大小分别约为619bp；大片段条带与空载体pEGFP-N2骨架在同一位置，大小约为4.7kb，符合预期结果，并经核酸测序鉴定序列正确，表明△TβRⅡ已经克隆至pEGFP-N2载体中；②重组质粒pEGFP/△TβRⅡ转染L02人胚肝细胞24h后在荧光显微镜下观察到融合蛋白EGFP的表达，并用G418筛选得到稳定表达的阳性克隆； ③MTT比色结果：转染重组子的实验组OD值显著高于转染pEGFP-N2的对照组OD值(0.780±0.012vs0.335±0.018，p＜0.05)；FCM结果显示前者的G1％(63.58)明显低于后者的G1％(73.03)，而增殖指数PrI值[(S+MG2)％]前者比后者高(36.42vs26.98)，证实融合蛋白EGFP/△TβRⅡ减轻TGFβ1对L02细胞生长抑制作用。 结论：成功构建了pEGFP/△TβRⅡ重组质粒，并表达了融合蛋白EGFP/△TβRⅡ，其胞外段有结合TGFβ1的活性，能显著减轻TGFβ1对L02细胞生长抑制作用，并能减轻TGFβ1对L02细胞G1～S的阻滞作用，为进一步探讨其生物学效应及在肝硬化中的作用奠定了基础。

目录

摘要

前言

材料与试剂

仪器与器材

实验方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

转化生长因子β及Smads与肝纤维化基因治疗策略

致谢

附录 硕士期间撰写的文章: