重组腺病毒AdCTLA4-FasL联合供者骨髓细胞输注方案诱导异基因混合嵌合耐受的实验研究

摘要

[目的]异基因混合嵌合体能诱导受者对供者移植器官特异耐受，从而能够避免器官移植后长期运用免疫抑制药物。但是，迄今为止还没有一种安全高效的异基因混合嵌合体诱导方案可供临床运用。在不对受体清髓处理的情况下，本研究探讨运用重组腺病毒AdCTLA4-FasL联合供者骨髓移植方案能否诱导混合嵌合体和同种皮肤移植耐受，同时探讨免疫抑制药物对该方案诱导的混合嵌合耐受的影响。 [方法]1.运用Adeasy系统重组腺病毒AdCTLA4-FasL，酶切、PCR、WesternBlot鉴定。2.将BALB/c(H-2d)小鼠皮肤移植于C57BL/6(H-2b，B6)小鼠，同时经尾静脉注射BALB/c小鼠骨髓细胞和腺病毒AdCTLA4-FasL；运用ELISA检测CTLA4-FasL融合蛋白在血浆中的表达，组织学分析了解该融合蛋白的肝细胞毒性，FITC标记的抗H-2d单抗对受体小鼠外周血白细胞标记后进行流式细胞仪分析检测异基因嵌合水平，观察皮肤移植物存活情况，运用有限稀释混合淋巴细胞培养方法估计辅助性T淋巴细胞前体(HTLp)和细胞毒T淋巴细胞前体(CTLp)的频数。3.将BALB/c(H-2d)小鼠皮肤移植于C57BL/6(H-2b，B6)小鼠，同时经尾静脉注射BALB/c小鼠骨髓细胞和腺病毒AdCTLA4-FasL，术后4周每天注射环孢素A(CsA)或霉酚酸酯(MMF)；然后观察移植皮肤存活情况，通过流式细胞仪测定受体外周血Vβ11+的T细胞的水平和供体来源细胞的嵌合水平，通过单向混合淋巴细胞反应了解对供体抗原的耐受状态。 [结果]1.重组腺病毒AdCTLA4-FasL的DNA通过PacI酶切证实为同源重组后的腺病毒，用特异引物经PCR证实含有外源基因CTLA4-FasL，WesternBolt表明细胞感染重组腺病毒AdCTLA4-FasL后能表达分泌性的融合蛋白CTLA4-FasL。2.腺病毒AdCTLA4-FasL能够在小鼠体内表达CTLA4-FasL融合蛋白，持续约56天左右，且无明显肝细胞毒性。该联合方案诱导了持久(140d时供体细胞＞20％)宏嵌合体(macrochimerism)；同时这种嵌合体促进了稳定的供体特异性耐受，BALB/c小鼠的皮肤移植物在B6受体小鼠中长期存活[themeansurvivaltime(MST)＞200d]，而来源于C3H小鼠的第三者皮肤移植物被该嵌合体小鼠正常排斥。该联合方案处理的B6小鼠在接受皮肤移植14天后，辅助性T淋巴细胞前体(HTLp)和细胞毒T淋巴细胞前体(CTLp)的频数降低到很低的水平，表明AdCTLA4-FasL能够迅速促进全面的外周耐受，从而有利于供体骨髓细胞植入。接受皮肤移植140天后，供体皮肤仅在形成长期嵌合体的受体小鼠中继续存活，这些小鼠体内供体特异性的HTLp和CTLp的频数减少，提示长期的皮肤移植物耐受与稳定的混合嵌合体有关，中枢性T细胞删除可能是耐受维持的主要机制。3.联合方案处理后短期加用免疫抑制药物均促进早期供体骨髓细胞植入；但单用CsA或CsA与MMF联用的受体小鼠在皮肤移植后140d时混合嵌合降低到很低水平；单用CsA或CsA与MMF联用的受体小鼠中供体皮肤平均生存时间显著低于不用免疫抑制药物或用MMF的受体小鼠(p＜0.05)；皮肤移植后21d时CsA或CsA与MMF联用的受体小鼠Vβ11+的T细胞水平显著高于不用免疫抑制药物或用MMF的受体小鼠(p＜0.05)；皮肤移植后150d时CsA或CsA与MMF联用的受体小鼠脾细胞未显示对同种抗原特异性耐受。 [结论]1.成功制备具有完整功能和感染能力的重组腺病毒AdCTLA4-FasL。2.AdCTLA4-FasL联合供者骨髓移植方案能诱导稳定的混合嵌合体和同种皮肤移植耐受。3.CsA或含CsA的免疫抑制方案抑制CTLA4-FasL重组腺病毒和供者骨髓移植联合方案诱导的混合嵌合耐受，其机理可能与早期外周供体特异性T细胞删除减少有关；而MMF与该嵌合耐受方案相容。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分表达人CTLA4-FasL融合蛋白的腺病毒载体的构建及鉴定

第二部分重组腺病毒AdCTLA4-FasL联合供者骨髓细胞输注诱导小鼠皮肤移植耐受

第三部分短期运用免疫抑制药物对非清髓异基因骨髓移植方案诱导的混合嵌合体和移植耐受的影响

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综述 混合嵌合体与移植耐受

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