天麻舒张血管活性成分的筛选及机制研究

摘要

缺血性脑血管疾病(Ischemic crebrovascular diseases，ICVD)是当今发病率、死亡率和致残率较高的疾病，其治疗原则是恢复供血、供氧、抑制缺血区炎症反应以及维持神经结构功能的完整性。其中早期恢复供血、供氧可减轻ICVD的脑损伤，而血管的舒缩调节功能及血管内皮释放的活性物质是恢复供血、供氧的重要保证。本课题组前期研究表明:天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，同时天麻乙酸乙酯提取物及酯溶性酚性成分能舒张大鼠离体胸主动脉环，其机制与抑制细胞外钙内流有关，提示天麻对血管的舒张作用是减轻脑缺血损伤的途径之一，因此本实验在前期工作的基础上，采用大鼠胸主动脉环离体灌流方法，从血管舒张的主要方式，内皮依赖及非内皮依赖角度对天麻舒张血管的活性成分进行追踪，并进行相关的机制研究。本实验分为以下五个部分。 1、天麻的提取与分离 目的:对天麻不同极性部位进行提取分离 方法:采用乙醇回流提取，乙酸乙酯萃取的方法，得总提物、乙酸乙酯提取物和水提取物。 结果:乙醇提取物得率为7.03％;乙酸乙酯提取物得率为0.3％;水提取物得率为10.2％。 2、天麻不同极性部位对大鼠离体胸主动脉环舒张作用的筛选 目的:筛选出天麻具有舒张血管的活性部位，为进一步研究奠定基础。 方法:采用离体血管灌流术，在苯肾上腺素(Phenylephrine，PE，10μM)及氯化钾（KCl，60mM）预收缩状态下观察不同浓度天麻总提取物、乙酸乙酯提取物、水提物对内皮完整及内皮去除血管环的舒张作用。筛选出舒张作用较强的部位，进一步进行分离提取，得到主要成分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ。 结果:(1)在内皮完整及去除内皮血管环中天麻乙醇提取物对PE和KCl预收缩均具有浓度依赖性(3、6、9、12、15、18 mg/ml)舒张作用; (2)在内皮完整及去除内皮血管环中天麻乙酸乙酯提取物对PE和KCl预收缩均具有浓度依赖性(0.75、1.5、3、6、9mg/ml)舒张作用，PE预收缩状态下，当浓度为0.75、1.5、3mg/ml时内皮完整组与去内皮组的舒张率比较差异无统计学意义（P＞0.05）;当浓度升高到6、9mg/ml时内皮完整组舒张率强于去内皮组，两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05); (3) PE预收缩状态下，水提物最大浓度(9mg/ml)对内皮完整血管环的舒张率仅为20％-30％，不做下一步分离和筛选; (4)乙酸乙酯提取物为主要的血管舒张活性部位，采用硅胶柱色谱法对其进行进一步分离提取，得到含量较多的五个酚性成分:Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ。 结论:天麻乙酸乙酯提取物为天麻舒张血管环的主要活性部位。 3、天麻酚性成分舒张血管环活性筛选及与血管内皮的相关性研究 目的:筛选出天麻酚性成分中具有舒张血管活性的成分，并明确舒张作用与血管内皮的相关性。 方法:采用离体血管灌流术，在PE预收缩状态下，观察不同浓度Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ对内皮完整及内皮去除血管环的舒张作用，筛选出舒张作用大于50％的活性成分，绘制量效曲线，计算IC50，并观察血管舒张作用与血管内皮的相关性。 结果:(1)Ⅳ、Ⅷ、Ⅵ、Ⅲ、Ⅱ(0.3、0.03、0.003mg/ml)对内皮完整及去除内皮血管环的舒张作用依次减弱，其中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ具有内皮依赖性舒张作用（P＜0.05）;Ⅵ为非内皮依赖性舒张作用（P＞0.05）。 (2)舒张率超过50％活性成分的IC50分别是:Ⅲ的IC50=1.5mM;Ⅳ的IC50=0.61mM;Ⅵ的IC50=0.46 mM;Ⅷ的IC50=2.91μM。 结论:天麻乙酸乙酯提取物中分离得到的酚性成分Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ为天麻舒张血管环的主要活性成分，其中Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ为内皮依赖性舒张，Ⅵ为非内皮依赖性舒张。 4、天麻舒张血管活性成分Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ内皮依赖性舒张机制的研究 目的:研究天麻舒张血管活性成分Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ的内皮依赖性舒张机制。 方法:(1)采用离体血管灌流术，在内皮完整时，分别加入左旋L-精氨酸甲酯(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester, Hydrochloride，L-NAM，一氧化氮合酶抑制剂，100μM)、亚甲蓝（Methylthioniniun Chloride，MB，可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂，10μM）、吲哚美辛(Indomethacin，Indo，环氧合酶抑制剂，10μM)孵育后，在PE预收缩状态下，累积加入Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ，分别观察对血管环的舒张作用。 (2)通过血管内皮细胞培养，观察Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ对内皮细胞一氧化氮(Nitricoxide,NO)释放的影响 ①采用细胞计数法描述内皮细胞的生长曲线，并采用MTT法观察Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ对正常血管内皮细胞的影响; ②采用硝酸还原法测定内皮细胞中NO的释放量并用ELIAS试剂盒检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性。 结果:(1)Ⅷ、Ⅳ、Ⅲ在Indo、MB、L-NAME三种阻断剂孵育后，对血管环的舒张作用明显减弱，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。 (2)不同浓度Ⅷ(0.001～10μM)、Ⅳ、Ⅲ(1～100μM)对ECs的生长无影响，与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，Ⅷ、Ⅳ、Ⅲ(1、3、10μM)能促进ECsNO的释放，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.01);同时，Ⅷ、Ⅳ、Ⅲ对eNOS的活性有增高的作用趋势，但与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论:天麻舒张血管活性成分Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ的内皮依赖性舒张机制由NO-sGC-cGMP通路、环氧合酶通路介导，并与促进内皮细胞中NO的释放有关。 5、天麻舒张血管活性成分Ⅵ非内皮依赖性舒张机制的研究 目的:研究天麻舒张血管活性成分Ⅵ的非内皮依赖性舒张机制。 方法:(1)采用离体血管灌流术，在去除血管内皮后以无钙液孵育，观察不同浓度Ⅵ对PE(10μM)预收缩的影响，稳定血管环再给予CaCl2(30mM)，观察Ⅵ对外钙内流和内钙释放的影响。 (2)去除内皮血管环以无钙液孵育，分别观察肝素（Heparin，三磷酸肌醇受体阻断剂30mM）、咖啡因（Caffeine，CF, RYR激动剂，3.0μM）、佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PD，蛋白激酶C受体激动剂，30μM）孵育后，不同浓度Ⅵ对血管环的影响。 结果:(1)去除内皮血管环以无钙液孵育，不同浓度Ⅵ((1～100μM)对PE引起的血管环收缩均表现为舒张作用，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），提示Ⅵ能够阻断内钙释放;稳定血管环再给予CaCl2（30mM），Ⅵ(10～3000μM)对血管环的收缩力与正常组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，提示Ⅵ在上述浓度下不能阻断外钙内流。 (2)不同浓度Ⅵ(30～3000μM)能够抑制Heparin、PD诱导的血管收缩（P＜0.01），提示Ⅵ舒张血管的机制与内钙储池上三磷酸肌醇受体及G蛋白偶联受体系统中蛋白激酶C受体有关;不同浓度Ⅵ(30～3000μM)不能抑制CF诱导的血管收缩，与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示Ⅵ舒张血管的机制与内钙储池上的RYR无关。 结论:天麻舒张血管活性成分Ⅵ的舒张机制与三磷酸肌醇受体和蛋白激酶受体介导阻断内钙释放有关。

目录

声明

英文索引表

摘要

前言

第一部分 天麻的提取与分离

1、实验材料

2、实验方法

3、实验结果

第二部分 天麻不同极性部位对大鼠离体胸主动脉环舒张作用的筛选

1．实验材料

2 实验方法

3 数据统计分析

4 结果

5 结论

6 讨论

第三部分 天麻酚性成分舒张血管环活性筛选及与血管内皮的相关性研究

1、实验材料

2、实验方法

3 数据统计分析

4 结果

5 结论

6 讨论

第四部分 天麻酚性成分内皮依赖性舒张大鼠胸主动脉机制研究

1 实验材料

2 实验方法

4 数据统计分析

5 结果

6 结论

7 讨论

第五部分 天麻酚性成分非内皮依赖性舒张大鼠胸主动脉机制研究

1、实验材料

2、实验方法

3 数据统计学分析

4、结果

5 结论

6 讨论

结论

参考文献

心血管疾病与内皮细胞间的关系

电压依赖性钙通道阻断剂的研究进展

致谢