滇南地区土壤放线菌的分离、鉴别及生物活性

摘要

放线菌隶属于放线菌门，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomyxida)。它们是与人类关系极为密切的一类微生物，具有广泛的物种多样性和代谢多样性，能产生众多的抗生素和具有生物活性的次生代谢物质，是重要的资源微生物。本设计对滇南部分地区的土壤放线菌进行生物活性筛选及分类鉴定研究，为云南省放线菌的充分开发利用提供理论依据和实验材料。
　　 本实验利用梯度稀释法，采用4种分离培养基，对来自滇南地区的10份土样进行了土壤放线菌的分离、发酵液杀虫、抑菌以及抗NCI-H460肿瘤细胞株的生物活性测定，并对分离获得的高拮抗活性放线菌菌株进行了分类鉴定。实验主要研究结果如下：
　　 (1)、放线菌分离采用稀释分离法，以高氏一号合成琼脂、蔗糖察氏琼脂、葡萄糖酵母膏琼脂和马铃薯浸汁琼脂4种培养基为分离培养基。从来自滇南地区的10份土样中共分离获得148株放线菌，其中高氏一号合成琼脂培养基分离出的菌株最多，共106株，占到分离总数的71.62％，超过了其他三种分离培养基分离数的总和。依据培养性状，对所分离的148株菌进行了初步归类，除6株为诺卡氏菌(Nocardia)外，其余菌株均隶属于链霉菌属(Streptomyces)。
　　 (2)、通过菌株发酵液杀虫、抑菌实验和对NCI-H460肿瘤细胞株的生物活性测定实验，共筛选出6株(菌株2-7、5-22、8-12、9-12、10-10和10-14)具有较高拮抗作用的菌株。小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫胃毒实验结果显示，菌株10-14具有与对照多杀菌素( Spinosad)相同的强烈杀虫效果，同时该菌株对供试的四种病原真菌(苹果炭疽病菌Colletolrichum gloeosporioides、油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum Becry、苹果轮纹病菌Macrophoma kuwatsukai和小麦赤枯病菌Gibberellazeae)的生长均具有100％的抑制作用(菌丝生长速率法测定)；发酵液杀线虫实验发现，菌株8-12对松材线虫(Bursphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer))具有高达98％的杀线效果；管碟法实验结果表明，菌株5-22与10-10，对红酵母(Rhodotorulasp.)及大肠杆菌(Escherichia coli)具有较好的抑制效果，对大肠杆菌的抑菌圈直径分别达到19.22mm和19.88mm；通过MTT法筛选出的2-7与9-12菌株，对肿瘤细胞株NCI-H460具有较好和较稳定的抑制作用，在发酵液稀释1000倍时，两株菌的抑制率分别为86.45％和89.29％，在发酵液稀释3000倍时，其抑制率也维持在50％以上。
　　 (3)、对生物活性实验所筛选出的6株具较高拮抗作用的放线菌(菌株2-7、5-22、8-12、9-12、10-10与10-14)，经形态特征、培养特征、细胞壁化学组分DAP及16SrDNA序列分析，确定6株菌均属于链霉菌属。初步鉴定结果如下：菌株2-7为链霉菌
　　 (Streptomyces albulussubsp. Tetrofungini)，5-22为浅灰链霉菌(Streptomycesgr iseolus)，8-12为不吸水链霉菌(Streptomyces a，ygroscopicus)，9-12为白灰链霉菌
　　 (Streptomyces albogr iseus)，10-10为春季链霉菌(Streptomyces verne)，10-14淀粉酶产色链霉菌79，(Streptomyces diastatochromogenes79)。其中菌株10-10虽与春季链霉菌(S.verne)的相似度为100％，但培养性状及孢子丝形态上有较大差异，春季链霉菌(S.verne)的孢子丝为长螺旋形，在多种培养基上，气丝不生长，但菌株10-10的孢子丝为直链状，在高氏l号，燕麦等培养基上气生菌丝生长旺盛。据此推测菌株10-10可能会是春季链霉菌的一个变种。
　　 (4)、本次实验分离获得的菌株10-14(淀粉酶产色链霉菌79)生物活性多样，对油菜菌核、苹果轮纹、小麦赤枯和苹果炭疽四种病原真菌的抑制效果均为100％。对二龄小菜蛾幼虫的灭杀效果与对照多杀菌素相同，对NCI-H460肿瘤细胞株的抑制率达到了82.97％(1000倍稀释液)，同时对红酵母的抑菌圈直径也达到了30.30 mm，在生物防治和医药上均具有巨大的潜力和开发利用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 前言

1.1 放线菌研究概况

1.1.1 国内放线菌研究概况

1.1.2 国外放线菌研究概况

1.1.3 国内放线菌研究的优势和不足

1.1.4 本项目研究的目的和意义

1.2 放线菌研究进展

1.2.1 放线菌分离方法研究进展

1.2.2 分离源研究进展

1.3 放线菌应用研究进展

1.3.1 医药上的应用

1.3.2 生物防治上的应用

1.3.3 其他领域应用的研究进展

1.4 现代生物技术在放线菌研究中的运用

1.4.1 分子遗传学的运用

1.4.2 基因工程技术

1.4.3 功能基因组学技术

2 土壤放线菌的分离与纯化

2.1 材料与方法

2.1.1 供试土样及土样预处理方法

2.1.2 培养基

2.1.3 供试仪器

2.1.4 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 放线菌分离结果

2.2.2 分离放线菌的初步归类

2.3 结论与讨论

3 分离放线菌生物活性的测定

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 培养基

3.1.3 培养方法

3.1.4 放线菌菌株发酵液生物活性的测定方法

3.2 结果与分析

3.2.1 放线菌发酵液对2龄小菜蛾幼虫的灭杀效果

3.2.2 供试菌株发酵液对松材线虫的灭杀效果

3.2.3 放线菌发酵液对四种病原真菌的抑制效果

3.2.4 放线菌发酵液对两种细菌和红酵母的抑菌活性

3.2.5 放线菌发酵液对NCl_H460肺癌细胞的生物活性检测结果

3.3 结论与讨论

4 菌株的鉴定

4.1 材料与方法

4.1.1 供试菌株

4.1.2 鉴定用培养基

4.1.3 主要仪器

4.1.4 鉴定方法

4.2 结果与分析

4.2.1 供试菌株的形态特征及培养特征

4.2.2 化学鉴定

4.2.3 分子鉴定

4.3 结论与讨论

5 结论与展望

5.1 结论

5.1.1 土壤放线菌的分离

5.1.2 放线菌发酵液生物活性的初步研究

5.1.3 菌株的鉴定

5.2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士研究生期间发表论文情况

附录