重组人成骨细胞刺激因子高效毕赤酵母表达系统的构建

摘要

目的：构建重组人成骨细胞刺激因子（recombinant human osteoblast-stimulating factor， rhOSF-1）高效毕赤酵母表达系统，获得rhOSF-1，为进一步研究该蛋白的在骨代谢性疾病中的作用打下基础。
　　 方法：(1)全基因人工合成的方法合成重组人osf-1基因，5’末端加酶切位点EcoRI，3’末端加终止子taa和酶切位点NotI。目的基因合成后连入pMD19克隆载体中，构建为pMD19/osf-1重组质粒，测序。(2)用EcoRI和Not1分别酶切pMD19/hrosf-1重组质粒和表达载体pPIC9k，1％琼脂糖凝胶电泳验证，切胶回收目的片段，使用DNA Ligation Kit将重组人osf-1基因与表达载体酶切片段连接，构建为重组质粒pPIC9k/hrosf-1，筛选阳性克隆进行测序鉴定。用SacI单酶切得到线性化重组质粒pPIC9k/osf-1及线性化空白对照pPIC9k，分别电转化至毕赤酵母菌GS115中。转化液涂布RDB平板，30℃培养72小时，挑取单克隆在MD平板上筛选His+表型，然后采用不同浓度梯度YPD-G418平板筛选多拷贝酵母菌重组子，挑取阳性克隆在MD及MM平板上筛选Mut+表型。提取酵母菌基因组DNA做模板，使用PCR的方法进行鉴定。(3)将筛选的阳性克隆菌株在YPD培养基中，30℃200rpm进行种培养；当OD600达2～4时，将种菌液接种BMGY培养液中，25℃及30℃200rpm分别进行主培养；当OD600达4～6左右时，3000rpm离心5min，BMMY培养液重悬菌体使OD600达1.5左右，与主培养时温度保持一致，200rpm进行甲醇诱导表达，甲醇浓度控制在1％，连续诱导120小时。每12h取菌液进行SDS-PAGE电泳，鉴定目的蛋白的表达情况。
　　 结果：全基因人工合成方法所合成的重组人osf-1基因的碱基序列与NCBI数据库中基因序列号为NM_002825的目的基因的碱基序列完全一致；pPIC9k/hrosf-1重组质粒构建正确；PCR证实pPIC9k/osf-1整合入了GS115的染色体；SDS-PAGE电泳分析示上清液中有相对分子量约18kD的明显条带。
　　 结论：重组人OSF-1可以在毕赤酵母表达系统中分泌表达，为后续得到纯化的目的蛋白，进一步研究其功能打下了基础。