靶向Survivin的siRNA基因治疗骨肉瘤的实验研究

摘要

第一部分survivin短发夹状RNA表达载体的构建及鉴定 目的设计并构建人survivin短发夹状RNA表达载体，测定其序列，并初步观察其抑制人骨肉瘤细胞survivinmRNA、蛋白表达及细胞增殖的情况，为应用survivin短发夹状RNA表达载体抑制人骨肉瘤细胞系MG-63增殖的实验研究提供基础。方法参照干涉RNA的设计原则，选择合适的靶序列，设计并合成出特异性的发夹状序列，将其接入pSilence2.1-neo表达载体，筛选阳性克隆，扩增后进行基因序列测定。脂质体介导pSilence2.1-neo-survivin载体转染人骨肉瘤细胞系MG-63，RT-PCR法检测转染前后人骨肉瘤细胞survivinmRNA的表达情况，免疫组化检测转染前后人骨肉瘤细胞survivin蛋白的表达情况,MTT法检测转染前后细胞增值情况的变化。结果经基因序列测定证实短发夹状RNA构建成功，RT-PCR结果显示，pSilence2.1-neo-survivin载体转染能显著抑制survivinmRNA及蛋白的表达，转染后24h、48h、72hmRNA表达抑制率分别为68.52％、74.87％和71.93％，其抑制作用在24h-48h逐步增加，48h-72h有所减低，余各组之间无明显差别。免疫组化结果显示PI值分别为空白组的37.76％、28.21％、33.34％。MTT法显示转染组24h、48h、72h、96h的细胞增殖抑制率分别为50.15％、61.83％、58.46％、42.35％。结论成功构建了survivin短发夹状RNA表达载体pSilence2.1-neo-survivin，并初步证实了其抑制survivin蛋白表达的效果，为进一步研究survivin干涉RNA抑制人骨肉瘤细胞增殖的实验研究提供了基础。 第二部分pSilence2.1-neo-survivin表达载体转染抑制人骨肉瘤细胞增殖的体外实验 目的检测pSilence2.1-neo-survivin表达载体稳定转染抑制人骨肉瘤细胞系MG-63survivinmRNA及蛋白表达的能力及其对人骨肉瘤细胞体外细胞增殖、细胞周期分布及细胞凋亡的影响。方法将pSilence2.1-neo-survivin表达载体通过脂质体介导转染人骨肉瘤细胞系MG-63，应用G418筛选阳性克隆，扩大培养，建立稳定转染pSilence2.1-neo-survivin表达载体的细胞系，RT-PCR法检测各组neo基因mRNA表达；RT-PCR法检测稳定转染后细胞survivinmRNA表达，Westonblot法和免疫组化法检测稳定转染后细胞survivin蛋白的表达，MTT法，克隆形成实验检测细胞增殖情况，流式细胞仪测定细胞周期变化，吖啶橙荧光染色法及TUNEL法检测稳定转染组细胞凋亡的情况。结果经G418筛选得到稳定表达pSilence2.1-neo-survivin的细胞，neo基因检测显示重组载体己整合到细胞中。对稳定转染组的检测显示：稳定转染组mRNA的表达为空白组的14.92％，Westonblot结果显示：转染组蛋白表达为空白组的18.86％。转染组细胞生长明显受阻，14天后转染组的细胞生长率为空白组的49.04％；MTT法显示培养24h、48h、72h、96h后与空白组相比，转染组细胞增殖抑制率分别为50.16％、63.41％、59.48％、43.41％，细胞周期分析显示，shRNA转染组G1期细胞含量为79.13％±5.66％，显著高于空白组(51.39％±4.13％)(P＜0.01)；shRNA转染组S期细胞含量为14.05％±3.78％，显著低于空白组(32.18％±2.12％)(P＜0.01)。转染组凋亡率为24.54％，而空白组仅为5.25％，两者有显著差异(P＜0.01)。吖啶橙染色显示，稳定转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24.54％。TUNEL法显示，载体组的凋亡率显著高与其余各组(P＜0.01)，其余各组间没有统计学差异(P＞0.05)。转染组的克隆形成率为30.06％,显著低于空白组(61.30％)和空载体组(55.61％)(P＜0.01)结论pSilence2.1-neo-survivin表达载体转染人骨肉瘤细胞后获得稳定表达的细胞系。同时该表达载体可显著抑制人骨肉瘤细胞survivinmRNA及蛋白的表达，pSilence2.1-neo-survivin转染可显著抑制MG-63细胞的细胞增殖活性，抑制细胞的DNA合成，促进细胞的凋亡。 第三部分pSilence2.1-neo-survivin表达载体抑制人骨肉瘤细胞增殖的体内实验 目的检测pSilence2.1-neo-survivin表达载体对人骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤模型生长的影响。方法将空白组、空载体组及稳定转染pSilence2.1-neo-survivin表达载体组细胞，接种到裸鼠腋部皮下组织，记录瘤体形成时间及肿瘤生长情况；光镜下观察其组织形态学变化结果细胞接种后，稳定转染pSilence2.1-neo-survivin表达载体组细胞体内致瘤能力降低，转染组成瘤时间为13.2±2.0天，空白组为6.5±1.6天，两者相比有显著性差异(P＜0.01)。5周时同空白组相比转染组瘤体体积小65.18％(P＜0.01)，重量轻59.07％(P＜0.01)结论pSilence2.1-neo-survivin表达载体转染能明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长，可作为人骨肉瘤基因治疗的合理方法之一。

目录

缩写词表

前言

实验流程图

第一部分survivin短发夹状RNA表达载体的构建及鉴定

第二部分pSilence2.1-neo-survivin表达载体转染抑制人骨肉瘤细胞增殖的体外实验

第三部分pSilence2.1-neo-survivin载体抑制人骨肉瘤移植瘤生长的研究

综述一RNAi的研究进展和siRNA

综述二Survivin——一个新的肿瘤特异性的抑制凋亡因子

博士期间发表的文章

致谢