RNA干扰靶向抑制表皮生长因子受体对大肠癌细胞增殖和化疗敏感性影响的研究

摘要

目的：构建针对EGFR的短发卡状RNA质粒表达载体，观察能否有效抑制大肠癌LoVo细胞株表皮生长因子受体(EGFR)的表达以及对细胞增殖的影响。确定有效的序列后，观察双位点的RNA干扰技术较单位点RNA干扰技术在抑制大肠癌LoVo细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达，诱导细胞凋亡以及增强5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性等方面是否有更明显的效果。 方法：体外合成EGFR短发卡状双链RNA和Pgenesil-1质粒构建两个表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2，脂质体瞬时转染人大肠癌LoVo细胞后24，48，72，96，144小时RT-PCR和Western-blot检测EGFRmRNA和蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，并绘制细胞生长曲线；确定两个质粒载体都能够进行有效干扰后，再以脂质体转染人大肠癌LoVo细胞，G418筛选4周，分5组：1组：LoVo细胞；2组：对照质粒载体HK；3组：pU6-EGFR-shRNA-1；4组：pU6-EGFR-shRNA-2；5组：pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2各半量。实时荧光定量PCR和Western-blot检测mRNA和蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率，细胞增殖分析试剂CCK-8(CellCountingKit-8)测定5-FU不同浓度和时间对LoVo细胞的抑制率和IC50。 结果：正确地构建了两个shRNA质粒表达载体，细胞转染成功；转染shRNA后LoVo细胞的mRNA和蛋白表达降低，G0-G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞凋亡率增加，对数生长期延迟，以48-72小时效果最显著，但随着时间的推移其干扰作用降低。进行G418稳定筛选后，PCR检测3组4组5组mRNA表达分别下降了(80.2±3.4)％、(81.3±2.8)％和(90.6±2.8)％，Western-blot检测蛋白表达分别下降了(74.1±4.0)％、(73.4±2.3)％和(90.4±3.3)％，流式细胞术检测细胞凋亡率增加了(10.4±0.5)％、(10.1±0.4)％和(14.2±0.5)％，同时对5-FU的IC50和细胞抑制率作统计学分析：5组，3组4组和1组2组三者之间比较有显著性差异，而1组2组间、3组4组间各项比较差异无显著性。 结论：构建的质粒载体可以成功的进行RNAi实验，两条EGFR-shRNA均可有效抑制大肠癌LoVo细胞EGFR表达，阻滞更多的细胞位于G0-G1期，促进细胞凋亡而抑制细胞增殖，并且能提高5-FU对癌细胞的杀伤作用，靶向EGFR的双位点的RNA干扰技术较单一位点的干扰效果更显著，为大肠癌的基因治疗联合化疗提供了新的思路。

目录

前言

第一部分shRNA质粒载体的构建和瞬时转染抑制大肠癌细胞表皮生长因子受体表达对细胞增殖的影响

第二部分双位点RNA干扰靶向稳定抑制EGFR对大肠癌细胞凋亡和5-FU化疗敏感性的影响

综述 大肠癌表皮生长因子受体靶向治疗进展

附录 攻读硕士学位期间发表的论文

致谢