RNA干扰靶向抑制SMYD3基因表达治疗肝癌的实验研究

摘要

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤，其全球发病率排列第5位，死亡率排列第4位。据全国肿瘤防治办公室和卫生部卫生统计中心的监测资料，在我国城市地区男性中发病率占第3位，女性占第5位，农村地区无论男性还是女性，肝癌的发病率都占第2位。目前临床上虽然有多种治疗手段，但是肝癌患者的长期生存率仍然不够理想，故寻求一种新的有效的治疗方法刻不容缓。越来越多的研究表明：组蛋白修饰从表观遗传学水平，通过调节下游基因表达参与多种肿瘤的发展与演变。新近发现的SMYD3基因编码具有催化组蛋白H3赖氨酸残基尾段上的K4甲基化位点发生甲基化活性的甲基转移酶，并且在胆管癌组织中表达阳性率达85.6％，充分提示了其与肿瘤的发生发展密切相关。 本研究首先利用RT-PCR和免疫组化证实了SMYD3基因在肝癌细胞及肝癌组织中高表达，初步说明了这种新的甲基转移酶在肝癌发生发展中的重要作用。为了更深入的研究SMYD3在肝癌发病机制中起的作用，以及探讨干预SMYD3能否成为治疗肝癌的新方法，本研究采用了RNAi技术：设计并合成靶向SMYD3基因的发夹状RNA片段，并克隆到载体Pgenesil-1，构建成重组表达质粒Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2，以及无干扰效应质粒Pgenesil-1-hk。转染入肝癌细胞后，结果显示Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2组细胞SMYD3mRNA和蛋白表达水平明显下调，而Pgenesil-1-hk组未见明显改变，这说明了RNAi作用的有效性；并且作为内参照的β-actin在各组表达水平相仿，说明了RNAi的特异性。本研究进一步通过MTT检测细胞生长增殖抑制率、体外侵袭实验检测细胞侵袭力、流式细胞术及TUNEL检测细胞凋亡、裸鼠移植瘤模型检测肝癌细胞在体成瘤能力：经RNAi特异性下调SMYD3表达后，肝癌细胞的生物学行为受到干预，增殖力、侵袭力明显减弱并且出现较为明显的凋亡，体外成瘤能力明显减弱。这些结果说明SMYD3在调控肝癌细胞生物学行为中的重要作用，并且提示了特异性干扰SMYD3的表达作为一种治疗肝癌新方法的可行性。本研究继而通过甲基化特异性PCR探讨了关于SMYD3发挥以上作用的具体内在机制：经RNAi特异性下调SMYD3表达后，肝癌细胞RIZ1基因启动子甲基化过程被逆转，mRNA表达被恢复。 综上所述，本研究通过研究RNAi特异性诱导SMYD3基因沉默对肝癌细胞生物学行为的影响及其内在机制，初步探讨了RNAi干涉SMYD3作为肝癌新的基因治疗方法的可行性和特异性。

目录

前言

第一部分SMYD3在肝癌细胞系和肝癌组织中的异常表达及意义

第二部分靶向抑制SMYD3表达的RNA干扰质粒载体构建及其沉默效应

第三部分靶向抑制SMYD3表达对肝癌生物学行为的干预作用的体内外实验研究

第四部分靶向抑制SMYD3表达改变肝癌生物学行为的内在机制研究

综述肝癌治疗的现状与趋势

在校期间发表论文清单

致谢