Real-time PCR检测肝细胞癌患者循环肿瘤细胞技术体系的建立及围手术期循环肿瘤细胞变化的临床研究

摘要

本研究分为二部分：
　　第一部分：Real-time PCR检测肝细胞癌患者循环肿瘤细胞技术体系的建立及围手术期循环肿瘤细胞变化的临床研究
　　背景：肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全世界最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤排行的第五位，其致死率居恶性肿瘤排行的第三位。近些年来，虽然HCC在我国发病率呈现下降趋势，但HCC的发病形势依然严峻。有数据显示，全球每年HCC新发病例78.2万人，死亡病例74.5万人，其中，我国的新发病例数及死亡病例数均占全球50％左右，仍处于世界之首。肿瘤切除或肝移植是该病最有效的治疗手段。然而，HCC的整体治疗效果并不理想，手术后五年生存率仅为15%-40%，两年内有62%-82%的患者复发。术后高转移、高复发已成为阻碍HCC预后提高的主要障碍，是肝细胞癌诊疗中亟待解决的关键问题。
　　HCC在转移方面有它不同于其它恶性肿瘤的特点：即淋巴结转移相对较少，以血行播散造成的肝内转移为主，晚期易发生远隔器官的转移；HCC患者手术过程当中因牵动肝脏极易引发医源性肿瘤细胞扩散，其原因可能与肝脏具有海绵状结构有关，牵动肝脏可使器官伸展和压缩，从而使部分肿瘤细胞入血。部分肝细胞癌患者在肿瘤切除或肝移植前，已有肿瘤细胞脱落进入血液循环系统，这些肿瘤细胞大部分在进入循环系统后会被免疫系统识别而被机体清除，但是仍有少量肿瘤细胞由于获得了新特征而能够在血液中存活，医学上将这部分细胞命名为循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）。CTCs既具有上皮细胞的部分特征，又具有肿瘤干细胞的部分特征。大量研究显示CTCs参与癌症的转移和复发等过程，因此外周血CTCs数量与肿瘤患者的预后、存活率等参数有很高的相关性。还有研究证明，CTCs的存在是远处转移的前提条件，入血的CTCs是导致HCC患者术后复发和转移的重要条件。对CTCs的分子生物学研究，有助于阐明肿瘤发生转移的具体机制。本课题通过建立检测HCC患者外周血CTCs的Real-time PCR技术体系，进一步检测HCC癌患者围手术期CTCs特异性靶基因表达的变化情况，探寻造成HCC血行转移的原因及CTCs播散的变化趋势，进而寻求避免HCC血行转移的方法。
　　目的：
　　1.建立检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞的Real-time PCR技术体系。
　　2.运用Real-time PCR技术体系研究肝细胞癌患者围手术期循环肿瘤细胞的变化情况。
　　方法：
　　1.文献调研：使用“Pubmed”和“中国知网”两个数据库进行文献检索， Pubmed以“HCC；CTC”为关键词，中国知网以“肝细胞癌；循环肿瘤细胞”为关键词；检索关于肝细胞癌与循环肿瘤细胞的中英文期刊、会议、毕业论文文献，从报道中寻找与HCC相关的靶基因。
　　2.靶基因筛选：通过肿瘤细胞系细胞Sprinking实验，筛选出一个或多个具有肝细胞癌CTCs特异性的靶基因。以HepG2为阳性细胞，以HL-60为阴性细胞作对照（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心），在106个 HL-60细胞中分别加入0、5、20、80、320、1280个HepG2细胞，应用Real-time PCR检测选候选靶基因（AFP、GPC3、CK18、CK19、CD133）表达的特异性及灵敏度。实验数据采用SPSS17.0计算机医学统计分析软件进行处理，统计图表的绘制采用SPSS17.0和Excel2003。
　　3.建立Real-time PCR检测肝细胞癌CTCs技术体系，初步检验体系的特异性和灵敏度：选取在2011年8月至2012年6月期间山东省肿瘤医院收治的肝细胞癌患者血液样本和山东省血液中心的正常人血液样本各8例，通过Real-time PCR技术体系对比肝细胞癌患者和正常人血液中AFP、GPC3、CK19三种基因的表达差别。实验数据采用SPSS17.0计算机医学统计分析软件进行处理，统计图表的绘制采用SPSS17.0和Excel2003。
　　4.肝细胞癌患者围手术期CTCs变化的临床研究：收集山东省肿瘤医院肝胆外科自2011年8月-2012年6月收治的初治HCC患者23例，分别于手术前1天和手术后第1、3、5、7、10天抽取其外周静脉血，采用Real-time PCR技术体系检测外周血中以mRNA为标记的CTC数目。采用SPSS17.0计算机医学统计分析软件进行数据处理，统计图表的绘制采用SPSS17.0和Excel2003。
　　结果：
　　1.文献调研结果：AFP、DCP、GPC3、MAGE-1/MAGE-3、GGT Hsubtype、hTERT、E-cadherin、CK18、CK19、Cadherin-17、CD90、CD133基因在肝细胞癌的临床诊断和治疗方面都已经表现出了巨大的应用潜力，本研究选取了AFP、GPC3、CK18、CK19、CD133作为候选靶基因。
　　2.在肿瘤细胞系细胞Sprinking实验中：1×106个HL-60细胞中加入至少5个HepG2细胞时，AFP、GPC3和CK19基因都能检测到差别，其中前两个基因更敏感，可作为目标靶基因。
　　3.技术体系灵敏度实验显示：AFP、GPC3和CK19三个目标靶基因在肝细胞癌患者和正常人之间基因表达量没有明显差别，无法对其进行区分。
　　4.针对23例肝细胞癌患者外周血的检测结果显示：外周血循环肿瘤细胞手术切除后较手术前靶基因表达量有所降低，但所筛选的AFP、GPC3、CK19三个基因在手术后1、3、5、7、10天没有检测到有统计学意义的变化。
　　结论：
　　1.HCC患者手术后外周血中CTCs较手术前有所降低，表明经手术切除肿瘤的治疗方式有可能预防HCC癌细胞的血行播散。
　　2.在Sprinking实验中，以AFP、GPC3、CK19为检测靶基因的技术体系具有较高的特异性和灵敏度，可以作为研究HCC患者CTCs的目标靶基因。
　　3.现阶段Real-time PCR技术体系在检测HCC患者外周血CTCs时，其灵敏度不足，有待进一步改进完善。
　　第二部分：高光谱成像技术检测肝细胞癌患者病理切片图像的研究
　　背景：高光谱成像技术是一种新型的信息获取技术，能够得到被探测目标的两维空间信息和一维光谱信息，它可以在本质上反映分子调控所引发生物体生理分子水平和整体机能的变化，反映引起生物组织生化成分变化的特定病理学因素。随着科技不断发展，近十年逐步出现了一种可用于获取显微样本化学成分信息的新的应用技术——生物医学光谱成像技术，可以通过光照到不同细胞上产生光谱作为该细胞的“指纹”，以区分不同细胞类型。将高光谱成像技术应用到肝细胞癌的辅助检测中，可能会提高肝细胞癌病理检测的效率。
　　目的：利用高光谱成像仪检测同张肝细胞癌病理切片中肿瘤细胞、正常细胞、淋巴细胞的差异，从而为建立一个辅助病理诊断系统奠定理论基础。
　　方法：选取2012年7月至2013年6月间由山东省肿瘤医院收治的肝细胞癌患者术后病理切片样15例。每例切片选择3个视野，每个视野均包含了肿瘤细胞、正常细胞及淋巴细胞。利用高光谱成像仪扫描每个视野，统计肝细胞癌病理切片的高光谱图像数据，通过三波段合成假彩色图像、统计光谱曲线以及多光谱融合三种方式进行图片处理，以图像形式直观显示结果。
　　结果：肿瘤细胞、正常肝细胞和淋巴细胞三者的细胞核光谱曲线具有差异性，其中在620nm差异较大，而在530nm差异较小，但此差异并不具有普遍规律。
　　结论：通过高光谱成像技术检测肝细胞癌病理切片，可获取一定的癌变信息。肿瘤细胞、正常细胞与淋巴细胞三者的细胞核对应的光谱曲线及图像有较明显差异，但差异并不具有普遍规律。