金黄色葡萄球菌肠毒素C2的制备研究

摘要

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是一类由Staphylococcus aureus(S.aureus)产生的外毒素,属于典型的超抗原(Superantigen,Sag),在极低的浓度下即可非特异地大量活化T细胞,从而达到增强免疫系统及杀伤肿瘤的效果。目前已发现的SEs约有20余种,包括:SEA~SEE、SEG~SEQ及TSST-1等,其中SEC又分为SEC1～SEC3三个氨基酸序列同源性大于96％的亚型。SEs具有良好的抗肿瘤理论及实践基础,但是单纯以SAg理论开发的抗肿瘤药物仍未上市。我国企业自主开发了以S.aureus发酵上清液为主要成分的金葡液制剂,已应用于多种肿瘤及其它疾病的辅助治疗。沈阳协和集团在其金葡液制剂高聚生?中检出微量SEC,并将SAg抗肿瘤理论应用于该产品。由于SEC在金葡液中含量甚微,与大量的菌体代谢产物及培养基成分共存,并且在临床使用中,金葡液还表现出了一些SAg理论难以解释的疗效,故难以判定SEC在金葡液抗肿瘤治疗中的关键作用。为了获得纯SEC蛋白,研究其抗肿瘤效果,本课题选择SEC三个亚型之一的SEC2作为研究对象,从天然产SEC2的S.aureus发酵上清液出发,通过超滤浓缩、硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析纯化获得天然SEC2(native SEC2,nSEC2)。通过这一方法得到的nSEC2纯度达到90%左右,但蛋白总量较少。由于本实验室在通过基因工程手段大量表达重组蛋白方面的技术已经比较成熟,根据SEC2来源于原核细胞,从天然产SEC2的S.aureus中获得sec2基因,克隆至E.coli大量表达重组SEC2(recombinant SEC2,rSEC2),通过阴离子交换层析和分子筛层析两步纯化得到纯度高于90%的rSEC2,蛋白得率高于nSEC2,并且该重组蛋白仅在N端比nSEC2多一个蛋氨酸(Met)。

目录

缩略词表

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英文摘要

第一章 天然金黄色葡萄球菌肠毒素C2的纯化研究

前言

实验材料与试剂

基本实验方法

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二章 重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的表达与纯化

前言

实验材料与试剂

基本实验方法

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第三章 带His-Tag的重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的表达与纯化

前言

实验材料与试剂

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第四章 SEC2分子二硫环缺口的形成研究

前言

实验材料与试剂

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

综述

研究生期间发表论文情况

致谢