永生化猪肝细胞系的建立及其鉴定

摘要

各种原因所致的急慢性肝功能衰竭,因其病情危重,进展迅速,病死率高,是临床亟待解决的治疗性难题.自人工肝支持系统(artificial liver supportsystem,ALSS)被用于治疗各种急性肝功能衰竭,已取得非常好的疗效.但是,由于非生物型人工肝缺乏肝细胞的代谢、生物转化等功能.然而生物型人工肝(bioartificial liver,BAL)依赖于生物反应器中的肝细胞发挥着肝细胞的氨代谢和生物转化等重要作用,可以弥补非生物型人工肝的上述缺陷,因此,近年来,以肝细胞为基础的生物型人工肝是目前人工肝治疗肝衰竭的研究热点,不同类型的BAL不断出现,迄今4种BAL系统业已开始进行Ⅱ-Ⅲ期临床验证,譬如HepatAssist、ELAD等.初步结果证明这些BAL治疗是安全、有效的,没有明显的不良事件出现. 由于供肝的短缺,生物型人工肝的发展亦面临着困难.然而,由于猪肝细胞的代谢功能与人肝细胞最为接近,目前大多数基础和临床研究均采用原代猪肝细胞作为肝细胞源.但是,由于原代肝细胞在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间及产量有限、难以传代等问题,这样就限制了生物型人工肝的发展.采用永生化技术建立永生化肝细胞,是解决生物型人工肝细胞来源的重要途径之一,可为生物型人工肝治疗肝衰竭提供大量的肝细胞成为可能. 本实验采用逆转录病毒载体的方法将SV40大T抗原(SV40 LT)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)导入到原代猪肝细胞,建立永生化猪肝细胞系.将为生物型人工肝系统体外评价、细胞移植、体外药物代谢模型等提供了理想的肝细胞源.材料与方法首先分子克隆技术分别构建含人端粒酶逆转录酶、SV40大T抗原重组逆转录病毒载体;用磷酸钙沉淀法分别将hTERT/pLPCX和SV40 LT/pLXSN转染至对数生长期的PT67细胞,经嘌呤霉素、G418药物压力筛选,建立两株产毒细胞株,并测定两种细胞上清的病毒滴度. 其次,用含SV40大T抗原的重组逆转录病毒上清感染原代猪肝细胞,G418药物进行压力筛选获得细胞克隆;接着,用含人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒上清感染细胞克隆,经嘌呤霉素筛选,建立永生化猪肝细胞. 最后,采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态;Western blot法检测永生化猪肝细胞中端粒酶和SV40大T抗原的表达;RT-PCR检测永生化猪肝细胞HepLP的ALB mRNA的表达;细胞增殖实验绘制细胞生长曲线;生化仪检测细胞上清的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)等指标; ELISA双抗体夹心法检测细胞上清的猪白蛋白;裸鼠致瘤性实验观察其有无肿瘤形成、以及进行细胞染色体核型分析. 结果： 成功的构建了hTERT/pLPCX和SV40 LT/pLXSN重组逆转录病毒载体,获得产生含hTERT、SV40 LT重组逆转录病毒的两种细胞株. 用含SV40大T抗原、人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒感染原代猪肝细胞,并经过筛选后获得三个耐嘌呤霉素和G418药物的永生化猪肝细胞克隆;并传代60代以上.并对其中一个命名为HepLP的永生化猪肝细胞进行鉴定.该细胞均为单层贴壁生长,肝细胞的形态呈椭圆形、典型的上皮细胞样特征.在透射电子显微镜下,所获得的猪肝细胞呈典型的肝细胞形态与结构,细胞内丰富的糖原颗粒和大量的线粒体以及内质网结构清晰可见; 在扫描电子显微镜下,永生化猪肝细胞的表面可见典型的微状突起物.永生化猪肝细胞呈典型的

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

课题小结及下一步拟开展的工作：

综述1：肝实质细胞和非实质细胞的永生化研究进展

综述2：肝细胞移植在肝衰竭中的应用研究进展

中英文对照缩写词表

在学期间发表的论文、课题、专利

致谢