淋巴瘤的病理诊断被公认为是临床病理中难度最大的,仅靠组织形态学以及免疫组化结果有时容易造成误诊及漏诊。随着分子生物学的发展,分子克隆分析无论是在淋巴瘤的初次诊断还是以后的随访中日益重要并且逐渐成熟,国外,特别是免疫球蛋白基因的克隆分析,已经用于B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL)的常规病理诊断。T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin iymphoma,T-NHL)是一种相对较少见且高度异质性的恶性淋巴瘤,目前国内外对T-NHL的病理诊断还不太乐观。T-NHL的病理诊断要解决两个问题,一是不是T-NHL?二是哪一种类型的T-NHL?也就是T-NHL的诊断和分类问题。关于第一个问题,由于T-NHL其形态多变以及免疫学上无克隆性标记,主张对所有的T细胞增殖性疾病进行分子克隆性基因重排分析,尤其是T细胞富裕的B细胞非霍奇金淋巴瘤。克隆分析淋巴瘤的原理是基于所有恶性淋巴细胞都有一个共同的克隆起源。目前淋巴瘤的分子病理诊断中,聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction,PCR)因其快速、简单、高效、廉价,敏感度高以及对DNA的质和量要求不高等优点而逐步取代了Southern blot。一般来说,PCR检测的高灵敏度期望是从新鲜的或冰冻的样本中分离得到DNA,而从福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed and paraffin embedded,FFPE)的组织样本中分离得到的DNA使其敏感性有所降低。不幸的是,在大部分的诊断病例以及回顾性研究中,仅能得到FFPE的组织样本。从FFPE的组织样本中分离出的DNA含有许多断裂的并伴有化学修饰的短小靶序列,不利于分子诊断。如何提高FFPE样本检测的敏感性是研究者面对的一个难题。另一方面不同文献中所选择的引物,PCR循环参数以及PCR产物分析方法都不尽相同,检测结果也有差异。因此,如何找到适合于常规临床病理诊断的标准程序是研究者面对的另一个难题。实际上与新鲜的或冰冻的样本相比,克隆分析FFPE样本的难度在于需要更多的实验,本研究获省科技厅项目(001110425)、浙江省自然科学基会项目(Y205292)和浙江省医药卫生科学研究基金(2006A084)资助其与大部分的体细胞基因PCR扩增相比更为复杂。以PCR为基础的克隆分析虽不是一项新颖的方法,但现有发表的文章很少有改变PCR参数扩增FFPE样本的DNA模板的研究分析。关于第二个问题,分化标记物表达的研究表明大多数T-NHL是由胸腺后T细胞的恶性转化发展而来的,因此这些恶性肿瘤被称为外周T细胞淋巴瘤(periferal T celllymphomas,PTCLs)。PTCLs一群高度异质性的恶性淋巴瘤,其诊断、分类及分子发病机制的研究一直是肿瘤病理学中最为困难和最有争议的领域之一。最新的2001年WHO分类标准,已经分化出了一些独立存在的肿瘤实体,如肠病相关性T细胞淋巴瘤(enteropathy type T cell lymphoma,ETTCL),间变性大细胞性T细胞淋巴瘤(anaplasticlagre T cell lymphoma,ALCL),血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-celllymphoma,AITL),鼻型T/NK细胞淋巴瘤以及肝脾γδT细胞淋巴瘤等等,除此之外,一种新PTCLs被分出,即非特指外周T细胞淋巴瘤(periferal T cell lymphomas,unspecified,PTCL-U),然而这一术语仅用来描述一类异质性的淋巴瘤,而这类淋巴瘤有不同的临床特征,组织学特点,基因改变,治疗反应以及相应的预后。因此,详细的PTCLs分类,尤其是PTCL-U有待于进一步的澄清。迄今为止,T-NHL的分类大致基于形态学或临床准则。最近研究表明,正常T细胞亚群趋化因子受体的表达模式与该细胞亚群分泌的细胞因子相关,CCR3选择性表达在人类或小鼠的Th2细胞,CXCR3选择表达在Th1细胞。基于以上原因,本实验以FFPE中T细胞受体(TCR)γ基因重排为研究对象,选用TCR多重引物,通过优化DNA提取以及PCR多个参数分析T-NHL中TCRγ基因重排,以建立PCR扩增中不同变量性能改变的重要意义。另选用一对TCRβ通用性引物作为TCRγ多重引物的补充和比较,同时联合最常用以及检测率较高的FR3A和FR2A通用性引物检测T-NHL中IgH基因的克隆性重排在本实验室T-NHL中的检测率。我们研究趋化因子受体中Th1相关标记CXCR3和Th2细胞相关标记CCR3在T-NHL中表达以评估其与临床病理的关系。材料与方法1材料(1)T-NHL标本:收集1997-2008年我医学院附属医院及省内其它医院的T-NHL标53例。全部标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4～5μm连续切片,除常规HE染色外,采用LCA(2B11,DAKO)、CD45RO(UCHL1,DAKO)、CD20(L26,DAKO)、CD30(Ber-H2,DAKO)免疫组化确定肿瘤的免疫表型。按照2001年WHO关于淋巴及造血系统肿瘤分类标准对所有病例进行分类:同时参照1992年Kail标准进行组织学高低级别分级。(2)对照组标本:收集反应性增生的淋巴组织石蜡标本4例,其中1例为淋巴结,3例为扁桃体。(3)Jurkat细胞:人类T细胞白血病细胞株,培养条件:选择RPMI1640(含10％胎牛血清)培养基,放入37℃,5%CO2～95%空气饱和湿度培养箱中孵育。待细胞生长接近融合成簇,离心收集后待用。2方法(1)免疫组织化学检测T-NHL中LCA,CD45RO,CD20,CD30的表达,确定肿瘤免疫表型。(2)选取6例T-NHL和4例反应性增生的淋巴组织,根据脱蜡时间与脱蜡温度不同分为两组,然后常规蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蜡组织DNA;TCRγ基因重排为研究对象,选用多重TCRγ引物,优化PCR循环参数。(3)采用PCR方法,联合TCRγ,TCRβ及FR3A、FR2A引物,检测53例T-NHL标本TCRγ、TCRβ及IgH基因克隆性重排,产物先2%琼脂糖电泳初筛,后行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。(4)选择Th1相关的细胞因子受体CXCR3和Th2相关的细胞因子受体CCR3,运用免疫组化方法检测这两种细胞因子受体在45例T-NHL中表达水平,评估其与临床病理的关系。(5)统计学处理:实验结果均使用SPSS16.0 for Windows软件包进行统计分析。3结果(1)根据免疫组织化学分型、组织学改变以及临床资料,同时参照2001年WHO关于淋巴及造血系统肿瘤分类标准对53例T细胞淋巴瘤进行分类,分为27例外周T细胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U),12例肠病相关性T细胞淋巴瘤(ETTCL),8例间变性大细胞T细胞淋巴瘤(ALCL),6皮下脂膜炎性T细胞淋巴瘤(SCPTCL)。(2)脱蜡时间长和脱蜡温度高的一组DNA质量以及产量较高。(3)FFPE样本TCRγ多重引物扩增中:TCRγA,B管40个循环达到最佳扩增效果;TCRγA管退货温度在50.9℃～65.5℃都可达到满意的扩增效果,而TCRγB管则需在50.9℃～56.7℃;TCRγA,B管所需引物量50pmol以上,Mg2+终浓度1.25～1.75 mM,dNTPs终浓度100～200 uM。(4)53例T-NHL中。采用优化的TCRγA,B管多重引物克隆性TCRγ基因重排检测率为62.3%(33/53),TCRβD2-J2通用性引物的检洲率为41.9%(23/53),联合TCRβ通用性引物,总检测率为66.0%(35/53)。(5)联合TCRγA,B管及FR3A、FR2A引物,7.6%(4/53)T-NHL检测到双重重排,免疫组化结果提示这4例均为T细胞表型。病理类型分别为3例外周T细胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U)与1例间变形性大细胞性T细胞淋巴瘤(ALCL)。(6)免疫组化检测45例T-NHL中CXCR3与CCR3表达水平,结果发现CXCR3与CCR3总的表达率为24.4%,不同病理类型之间表达无显著性差异(P>0.05)。4结论(1)延长脱蜡时间以及提高脱蜡温度有助于提高FFPE样本中DNA的质量和产量。(2)对TCRγ多重引物增加PCR循环次数有助于提高劣质DNA的扩增率,增加引物浓度,轻微增加的Mg2+浓度结合标准量dNTPs可以改善TCRγ基因的克隆检测。(3)在TCRG多重引物优化过程中,我们的实验有助于确定哪一个参数以及如何改变来减少假阳性或假阴性。(4)采用优化的TCRγA,B管多重引物,克隆性TCRγ基因重排在T-NHL中检测率高于TCRβ通用性引物D2-J2,但联合TCRβ通用性引物D2-J2,可以提高总检测率。(5)基因重排与淋巴瘤细胞的免疫表型并不一致。不能通过基因重排来确定T、B细胞系来源,除非必须同时进行Ig和TCR基因重排,排除其一才能确定其细胞系来源。(6)根据肿瘤细胞是否表达CXCR3或CCR3来进一步分类T-NHL,还需进一步的实验验证。
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