大鼠肺动脉高压模型中循环血小板和白细胞的活化及血小板信号转导通路研究

摘要

背景和目的：特发性肺动脉高压(Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertention,IPAH)是一种少见的肺血管疾病,其主要特征是肺动脉压力和肺血管阻力进行性增高,最终导致右心衰竭和死亡。IPAH基本病理学特点是肺小动脉内皮增生和纤维化、中膜肥厚、原位血栓形成、炎症和丛状样变。临床统计显示约50％的特发性肺动脉高压患者伴发慢性肺血栓栓塞。血小板是血栓形成中最重要的细胞,循环血小板激活能够促进肺血栓栓塞。关于血小板在肺动脉高压中的作用,并无定论。有的文献报道在IPAH中,血栓形成的先决条件-血小板聚集反应明显增强,血液中p-选择素增加,均提示血小板处于活化状态。但是,另有文献报道,在IPAH患者中,血小板因子4和血小板球蛋白B等标志血小板活化标志物在血液中没有增加,说明并不存在血小板活化。现已证实,血小板和白细胞间存在复杂的相互作用,这种相互作用能够增加血小板和白细胞的活化,促进炎症和血栓形成。血小板-白细胞聚集体(platelet-leukocyte aggregations,PLAs)是这种相互作用的一种方式。该聚集体能够促进许多疾病的发生发展,如动脉粥样硬化、急性肺损伤等。炎症和血栓是IPAH的主要病理改变,但是在IPAH中尚未见有关血小板、白细胞活化以及血小板-白细胞聚集体的系统报道。在IPAH中是否存在循环血小板和白细胞的活化以及血小板-白细胞聚集体形成增加?它们能否促进疾病的发生发展?这些是非常有趣而且值得研究的问题。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究证实,MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内,在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内,并引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用。现已有研究证实MAPK信号转导通路的活化参与血小板的变形、粘附和聚集反应。并且在肺动脉高压发生中,已经发现肺组织的MAPK通路活化,能够促进平滑肌增殖,外膜成纤维细胞增生等。抑制p38的活化,能够降低肺动脉压力,减少肺动脉肌化,抑制肺动脉高压的进展。在肺动脉高压中,循环血小板内是否也存在该通路的活化?该通路的活化能否引起血小板功能改变,从而促进IPAH的进展?这些问题尚需进一步研究。因此,我们利用野百合碱(monocrotaline,MCT)诱发大鼠肺动脉高压,应用导管法行血流动力学测定,检测大鼠肺动脉压力和右心室压力,肺病理切片HE染色观察大鼠肺血管形态学改变,以确定肺动脉高压模型的成功建立。采用全血流式细胞术,检测肺动脉高压时是否存在循环血小板、白细胞的活化和PLAs形成的增加,同时,应用western blotting检测活化血小板的可能信号转导通路。方法:1.肺动脉高压动物模型:2%野百合碱皮下注射,诱导大鼠肺动脉高压。对照组皮下注射1ml生理盐水。2.HE染色病理切片:观察大鼠肺动脉高压模型中肺动脉和肺组织形态学改变。3.血液动力学检测:注射野百合碱后,3周末测量右心室收缩压(RVSP)、肺动脉平均压(mPAP)。4.全血流式细胞术测定:血小板纤维蛋白原的结合率、白细胞CD11b的表达和血小板-白细胞聚集体的形成。5.western blot法测定:血小板MAPK信号转导通路中p38MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化。结果:1.成功建立肺动脉高压动物模型:大鼠在注射野百合碱第三周后,出现进食减少、体重减轻、活动减少、呼吸急促、口唇及四肢紫绀、解剖可见大量腹水。2.肺组织病理切片可见肺动脉高压大鼠的肺小动脉中膜较正常大鼠明显增厚,官腔狭窄。3.血流动力学测定:肺动脉高压模型组大鼠右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP)均较正常对照组明显上升。4.全血流式细胞术检测:在基础状态下,与正常对照组相比,模型组血小板纤维蛋白原的结合率显著升高(p<0.01);加入血小板刺激剂ADP(浓度为10-6mol/L)时,模型组血小板纤维蛋白原的结合率与正常对照组相比,亦显著升高(p<0.01)。在基础状态下,模型组中性粒细胞、单核细胞亚群CD11b的表达较正常对照组明显增高(p<0.01),淋巴细胞亚群CD11b的表达与正常无差异(p>0.05)。当加入白细胞刺激剂fMLP(浓度定为10-7mol/L)时,模型组中性粒细胞亚群CD11b的表达较正常对照组明显增高(P<0.01),而单核细胞、淋巴细胞亚群CD11b的表达与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。在基础状态下,模型组血小板-中性粒细胞(P-Neu)聚集体百分率较正常明显增高(P<0.01)。加入血小板刺激剂ADP(浓度定为10-6mol/L)时,模型组P-Neu聚集体形成率比正常对照组明显增高(P<0.01),而P-Mon、P-Lym聚集体在模型组和正常对照组之间无显著性差异(P>0.05)。5.Western blot法检测血小板MAPK信号转导通路:在模型组大鼠的血小板内检测到磷酸化的p38和JNK增加。而ERK的磷酸化没有改变。结论:1.野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型,3周末平均肺动脉压和右心室收缩压增高,肺小动脉中膜增厚,官腔狭窄,甚至闭塞。2.大鼠肺动脉高压模型中存在循环血小板和白细胞的活化,并且对刺激剂敏感性增加;血小板-中性粒细胞聚集体形成明显增加。3.在大鼠肺动脉高压模型的血小板中p38-MAPK和JNK蛋白磷酸化增多。

目录

一 中文摘要

二 英文摘要

三 论文正文

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 参考文献

四 综述

五 致谢