葡萄籽原花青素提取物预防龋病的实验研究

摘要

目的:研究葡萄籽原花青素提取物(GSPE)对变形链球菌生长、产酸及防龋作用,探讨防龋机制。方法:实验一:选用国际标准菌株,变形链球菌族(以下简称变链菌)的变形链球菌(S.mutans Ingbritt,血清型c)和远缘链球菌(S.Sobrinus6715,血清型g),在含1％蔗糖的胰蛋白酶消化大豆液体培养基(TSB)中厌氧培养(CO280%,N210%,H210%),采用液体/琼脂稀释法体外抑菌试验分别测定葡萄籽原花青素提取物(GSPE)和茶多酚(TP)对两种变链菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。通过测定MIC值以下4个浓度梯度培养前后PH值的变化,并以不加药的培养液为对照,进一步观察GSPE对变形链球菌产酸能力的影响。变链菌在浓度为1/2 MIC的GSPE的TSB中培养24 h,离心得菌体,以生理盐水洗3次,离心,用2%(v/v)pH7.4的戊二醛固定液固定,4℃保存,10 mg/ml四氧化锇后固定,室温保存1 d,醋酸铀染色后经一系列不同浓度的酒精逐级脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,枸椽酸铅染色,透射电镜下观察GSPE作用后S.mutans Ingbritt和S.Sobrinus6715的形态学变化。实验二:选择21 d鼠龄断乳Sprague-Dawby(SD)大鼠24只,随机分成3组,每组8只,雌雄各半,分别为葡萄籽原花青素提取物(GSPE)溶液、茶多酚(TP)溶液、蒸馏水(H2O)组。21～23 d鼠龄期间给予古有广谱抗生素(2 kg饲料加氨苄青霉素、氯霉素各1g)的致龋饲料2000＃,其它时间的饲料中不加抗生素。在鼠龄24～28 d期间,连续5 d于口腔内接种变形链球菌S.Sobrinus6715(105～6CFU/ml),每次接种100 ul。自29 d起各组分别用MIC浓度的GSPE溶液4 mg/ml、TP溶液2 mg/ml、蒸馏水处理。大鼠取仰卧位,将0.3 ml药物用钝针头注射器注于大鼠牙面及口腔,维持15 s,每天处理1次,处理后30 min内禁饮食。连续处理60 d后处死大鼠,采用Keyes龋齿评分法观察、评估大鼠磨牙牙合面窝沟患龋情况,采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析和均数两两比较,总结GSPE对Sprague-Dawley大鼠磨牙牙合面窝沟龋的预防效果。结果:实验一:①GSPE对S.mutans Ingbritt和S.Sobrinus6715的MIC均为4.00mg/ml,MBC均为8.00 mg/ml;TP对S.mutans Ingbritt和S.Sobrinus6715的MIC均为2.00 mg/ml,MBC均为4.00 mg/ml。②产酸抑制实验中MIC值以下4个浓度的前三个浓度(2.00 mg/ml,1.00 mg/ml,0.50 mg/m1)与对照组比较对变形链球菌产酸有明显的抑制作用(P<0.05),第四个浓度(0.25 mg/ml)无明显抑制作用(P>0.05)。③透射电镜观察发现GSPE主要引起S.mutans Ingbritt细胞水肿、细胞壁破坏,S.Sobrinus6715细胞质空泡性变。实验二:动物实验发现GSPE和TP均能抑制大鼠龋病的发生发展(P<0.05),而GSPE组与TP组相差不显著(P>0.05);Dx级龋损仅见于蒸馏水组,葡萄籽原花青素提取物(GSPE)组及茶多酚(TP)组均未发生Dx级龋损。结论:本研究表明,GSPE能抑制变形链球菌和远缘链球菌的生长、产酸,对变链菌的主要影响是菌体的细胞水肿、细胞壁破坏,细胞质空泡性变,GSPE能减少实验SD大鼠龋病的发生,减轻龋蚀程度,可以考虑用于龋病预防。

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