MAPEG在胚胎干细胞衍生肝组织及胚胎器官发育中的表征

摘要

第一部分：MAPEG在小鼠胚胎干细胞体外衍生肝组织发育依赖性表征目的:探索MAPEG在mES细胞体外衍生肝组织模型表征,旨在为揭示其在肝脏体外发育过程生命现象本质提供有价值的实验依据并探讨潜在的应用前景。方法:1.采用mES细胞分化技术,构建mES细胞衍生肝组织模型。RT-PCR法检测mES细胞未分化基因OCT4、心肌细胞特异性基因(MLC-2V)、肝细胞发育依赖性基因(AFP、HNF3β、ALB、CYP7al、G6P)、内皮细胞标记物血小板-内皮细胞黏附因子(PECAM-1)表达情况;细胞免疫化学鉴定肝细胞特异性标记物白蛋白(ALB),心肌特异性标记物肌钙蛋白(Troponin T),内皮细胞特征性蛋白(PECAM-1); ELISA法考察衍生肝组织白蛋白合成分泌功能。2. RT-PCR测定该模型中MAPEG家族mRNA表达;Western blot和免疫细胞化学方法考察MAPEG家族蛋白表达;采用MGST1与底物GSH和CDNB的催化实验来测定衍生肝组织MGST1的催化活性;采用过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)与衍生肝组织MGST1共孵育,后用Western blot检测MGST1是否以蛋白二聚体形式被修饰激活。结果:1.mES细胞体外衍生肝组织鉴定:(1)细胞形态学:呈双核成熟肝细胞表型区域附近伴有节律性收缩心肌细胞共存;(2)基因转录层面:发育依赖性表达特征如下:多潜能基因OCT4逐渐减弱,心肌细胞特异性基因MLC-2V、内皮细胞特异性基因PECAM-1依此增强,肝细胞特异性基因AFP先上升后消失、HNF3β、ALB、CYP7al、G6P发育依赖性表达增强;(3)蛋白翻译层面:该衍生肝组织发育依赖性表达肝、心肌、内皮细胞特征性蛋白ALB、Troponin T和PECAM-1。(4)白蛋白分泌功能:该衍生肝组织细胞培养液中白蛋白分泌量在分化过程中逐渐增加,至D18开始达峰值并趋于平缓。较原代培养肝细胞维持时间长且处于较高水平。2.MAPEG家族基因转录层面表征:除MGST3在分化过程中维持恒定表达,MAPEG家族其他5个成员均在mRNA水平随着mES细胞体外衍生肝组织分化成熟呈发育依赖性增强。3.MAPEG家族蛋白翻译层面表征:6个蛋白存在不同表达模式,MGST1蛋白在分化D14出现,随着分化进行逐渐增强;LTC4S和mPGES-1在整个分化过程中呈发育依赖性递减,而FLAP蛋白在分化过程中维持恒定表达;MGST2和MGST3均未检测到蛋白表达。4.MGST催化功能和修饰激活特征:分化D18衍生肝组织MGST1的催化活性为7.65 nmol/min/mg;但此时衍生肝组织MGST1和胎鼠E18肝(见阴栓之日记为E0)MGST1一样,均不能被活性氮如ONOO-以蛋白二聚体的形式修饰激活。结论:1. MAPEG在mES细胞体外衍生肝组织中均具有基因转录基础;蛋白表达未完全相一致的现象,既可能与肝组织功能尚未完善相关,也可能与该类蛋白为功能蛋白,仅在需要时瞬时表达相关。且提示该模型可望用于花生四烯酸相关的炎症通路研究。2.mES细胞体外衍生肝组织MGST1具有催化功能,但未能被活性氮以二聚体形式修饰激活,该特征与小鼠胚胎肝组织来源MGST1相一致。提示该衍生肝组织MGST1不具备在亲电子物质侵袭过程修饰激活而增强解毒功能的特性。3.mES细胞体外衍生肝组织模型具有成熟肝细胞和血管内皮细胞表型,发育依赖性表达肝细胞特征性基因,并具备白蛋白合成分泌功能。该模型可望用于体外肝脏发育学、肝脏生理病理学、肝组织代谢、药理毒理学评价,乃至再生医学细胞移植和组织工程等研究。第二部分MAPEG在大鼠胚胎器官形成过程中的表达特征目的:MAPEG广泛分布于肾、肺和脑等多种器官组织。因小鼠早期胚胎各器官体积过小而存在取材困难,大鼠和小鼠同属啮齿类动物,具有较好的类比性,本部分进一步探索MAPEG家族在大鼠胚胎发育过程中,脑、心、肺、肝和肾等主要组织表达特征,为揭示该家族的体内发育生物学本质和意义提供实验依据。方法:1.收集SD大鼠E14、E16、E18、E20、新生大鼠、成年大鼠脑、心、肺、肝、肾5个组织(阴道查得精子之日为E0)。2.RT-PCR测定各组织发育过程中MAPEG家族各成员mRNA表达。3. Western blot和免疫组织化学法考察MAPEG家族相应蛋白表达。4.MGST1与底物GSH和CDNB催化实验来测定MGST1催化活性;ONOO-与胚胎MGST1共孵育,后用Western blot检测MGST1是否在体外以蛋白二聚体形式被修饰激活。HPLC法分别检测白三烯合成酶系和mPGE-1催化功能。结果:1.MAPEG家族基因转录层面表达模式:除MGST2未在胎肺组织中检测到,其余5个成员均可在胎鼠脑、心、肝、肾组织中检测到,并呈不同程度发育依赖性表达特征。2.MAPEG家族蛋白翻译层面表达模式:MGST1在胎肝、肺组织中发育依赖性递增,在胎脑组织中则表达呈发育依赖性递减,而在胎心、肾组织中未见表达。除胎肺组织之外,MGST2在E18胎鼠其他4个组织均有表达。MGST3和LTC4S在各器官形成过程中呈发育依赖性增加。FLAP在胎脑、心、肾发育过程中表达逐渐增强,而在胎肝、肺组织中表达先增强后减少,分别在E16和E18达表达高峰后下调。mPGES-1在脑和肝组织中发育依赖性递减,而心脏组织中mPGES-1表达从E14至E18逐渐递增,后逐渐下降。但在肺和肾中呈发育依赖性递增。此外,MGST3、LTC4S、FLAP和mPGES-1在胚胎期表达均高于成年期。3.MGST1催化功能和修饰激活特征:胎肝MGST1催化活性发育依赖性增强,但弱于成年期。胎脑和胎肺MGST催化活性未呈发育依赖性变化,且活性均低于胎肝。胎肝MGST1能被ONOO-以蛋白二聚体形式修饰激活,而胎肺MGST1不能被修饰激活。4.白三烯合成酶系催化功能:5个组织中白三烯合成酶系均具有合成LTC4能力,且呈发育依赖性增强,但均弱于成年大鼠相应组织。除了胎肺,MGST2均参与了催化LTC4的合成。5.mPGES-1催化功能考察:在胚胎肝和脑发育过程中mPGES-1催化能力逐渐减弱,而其他组织中催化能力则逐渐增强。结论:1. MAPEG在大鼠胚胎器官形成过程中具有器官分布特异性和不同发育依赖性表征,可能与不同器官功能需求差异和形成完善相关,也可能与该类蛋白为功能蛋白,仅受特定条件下调控表达相关。且提示大鼠胚胎器官具备花生四烯酸相关炎症通路的物质基础。2.大鼠胎肝MGST1具备催化亲电子物质与谷胱甘肽结合功能,且可被活性氮以蛋白二聚体形式修饰激活。大鼠胎肺和小鼠胎肝MGST1则不能被活性氮修饰激活,提示MGST1修饰激活特性具有组织和种属专属性。3.LTC4合成酶系在大鼠胚胎5个组织中蛋白表达与催化活性均呈发育依赖性递增,且除胎肺外,其他组织MGST2均参与了催化LTC4合成。提示MGST2、LTC4可能与多种胚胎器官形成和功能完善相关,具有普遍发育生物学意义。4.胚胎组织中mPGES-1具备催化合成PGE2的能力,呈不同发育依赖性变化,提示胚胎期mPGES-1有多重生物学功能,催化能力与不同胚胎组织的需求和功能差异相关。

目录

致谢

前言

中文摘要

Abstract

缩略词表

1. MAPEG在小鼠胚胎干细胞体外衍生肝组织发育依赖性表征

引言

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

1.1.2 主要试剂及配制

1.1.3 细胞系

1.2 实验方法

1.2.1 mES细胞衍生肝组织构建

1.2.2 mES细胞衍生肝组织鉴定

1.2.3 MAPEG发育依赖性表达特征考察

1.3 实验结果

1.3.1 mES细胞衍生肝组织鉴定

1.3.2 MAPEG家族发育依赖性表征

1.4 讨论

1.5 小结

2. MAPEG在大鼠胚胎器官形成过程中发育依赖性表达特征

引言

2.1 仪器和试剂

2.1.1 仪器

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要试剂及配制

2.2 实验方法

2.2.1 动物饲养

2.2.2 样本收集

2.2.3 RT-PCR法检测组织内mRNA表达

2.2.4 Western blot法检测组织内蛋白表达

2.2.5 免疫组织化学

2.2.6 MGST1催化功能考察

2.2.7 活性氮对胎肝和胎肺总蛋白中MGST1修饰激活考察

2.2.8 白三烯合成酶系催化能力考察

2.2.9 mPGES-1催化能力考察

2.2.10 数据分析

2.3 实验结果

2.3.1 MGST1基因及蛋白表达谱

2.3.2 MGST2基因及蛋白表达谱

2.3.3 MGST3基因及蛋白表达谱

2.3.4 LTC4S基因及蛋白表达谱

2.3.5 FLAP基因及蛋白表达谱

2.3.6 mPGES-1基因及蛋白表达谱

2.3.7 MGST1催化功能考察

2.3.8 活性氮对胎肝、胎肺总蛋白中MGST1修饰激活考察

2.3.9 白三烯合成酶系催化功能考察

2.3.10 mPGES-1催化功能考察

2.4 讨论

2.5 小结

3.LPS处理孕大鼠诱发胎脑MAPEG表达特征

引言

3.1 仪器和试剂

3.1.1 仪器

3.1.2 实验动物

3.1.3 主要试剂及配制

3.2 实验方法

3.2.1 动物饲养

3.2.2 样本收集和胚胎存活率统计

3.2.3 RT-PCR法检测胎脑组织内mRNA表达

3.2.4 Western blot法检测胎脑组织内蛋白表达

3.2.5 ELISA法检测胎脑组织CysLTs含量

3.2.6 数据分析

3.3 实验结果

3.3.1 孕鼠LPS处理后给不同药物对胚胎存活影响

3.3.2 胎脑MAPEG基因变化

3.3.3 胎脑MAPEG蛋白变化

3.3.4 胎脑MAPEG产物变化

3.4 讨论

3.5 小结

参考文献

综述:MAPEG发育依赖性表达特征与功能研究进展

参考文献

作者简历及在学期间所取得的科研成果