Bacillus sp.C3细胞色素P450:CYP102A16基因的克隆、优化表达及其酶性质研究

摘要

细胞色素P450(cytochrome P450或CYP450,简称P450)是在生物界内广泛分布的一类血红素蛋白超家族末端加氧酶,主要参与内源性物质和外源性物质的代谢作用。P450是生物界中最具催化多样性的生物催化剂,能催化许多结构不同的物质发生羟基化、环氧化、脱烷基化、脱氨、脱氢、脱卤素等反应,使许多难降解化合物转化为可生物降解物质。因此,P450在环境污染物的修复治理方面的应用探索成为近年来的一个研究热点。
　　 本论文从实验室保存的一株芽孢杆菌Bacillus sp.C3中分离克隆到了一新型细胞色素P450基因:CYP102A16,构建了该基因的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中成功表达,通过发酵条件优化提高酶的活性表达量,经亲和层析纯化获得CYP102A16纯酶,并对该酶的各项酶性质进行了系统的研究。论文的主要研究结果如下:
　　 1)CYP102A16基因的克隆与表达
　　 利用简并PCR的方法从Bacillus sp.C3菌株中成功克隆到细胞色素P450全长基因并测序,得到3198 bp的片段,编码1065个氨基酸残基,推测分子量约为120.9 kDa。该基因已提交GenBank数据库(FR775424),由细胞色素P450国际命名委员会(CytochromeP450 Nomenclature Committee)将其系统命名为CYP102A16。成功构建表达质粒pET28a(+)-CYP102A16,并转化E.coli BL21(DE3),诱导表达的粗酶液经Ni-NTA6×His-tag亲和层析纯化获得了纯度为84％的CYP102A16蛋白。该蛋白在SDS-PAGE图谱约119 kDa处呈现很浓的条带。
　　 2)CYP102A16酶的发酵条件优化
　　 通过单因素实验和统计学的实验设计方法分别对CYP102A16异源表达的培养条件和发酵培养基组分进行了优化,实现了重组cYP102A16的高效表达,产量达0.43μmol·L-1,提高了3.65倍。
　　 3)CYP102A16酶活性及稳定性研究
　　 研究了温度、pH、有机溶剂、表面活性剂、金属离子等因素对CYP102A16酶活性及稳定性的影响。结果发现:CYP102A16的最适反应温度为35℃,最适反应pH为6.5-7.5,该酶在45℃以下,pH5.0-10.0范围内稳定;CYP102A16能完全耐受20％DMSO、30％甲醇、10％乙醇和20％丙酮,经10％的乙腈、正丙醇和异丙醇处理后残余酶活在45％以上,经10％的正丁醇处理几乎失活;添加低浓度的CPC(0.003-0.02 g·L-1)和Triton X-100(0.1-0.2 g·L-1)可使CYP102A16酶活分别提高40％和60％左右,低浓度的SDS(0.004-0.008 g·L-1)对CYP102A16的酶活无显著影响;1-20 mM K+、20-50 mM Na+、0.05 mM Cd2+对CYP102A16酶活表现轻微促进效应,NH4+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和EDTA均能不同程度的抑制CYP102A16的活性。
　　 4)CYP102A16酶的稳态动力学研究
　　 CYP102A16对中长链脂肪酸有偏好性,对不饱和脂肪酸的结合力强于饱和脂肪酸,伴随饱和脂肪酸碳链的增长,KD值增大,结合强度减弱。CYP102A16对软脂酸的亲和力最强(Km=10.1μM),其对饱和脂肪酸(除软脂酸外)的Km明显高于不饱和脂肪酸。该酶对各脂肪酸的催化转化效率(Kcat)相对较低,约在110～580 min-1范围内。
　　 5)CYP102A16酶的底物谱分析
　　 以29种P450酶的潜在底物为对象,对CYP102A16进行了底物谱分析。结果发现:除了天然底物中长链脂肪酸外,CYP102A16还对短链脂肪酸(＜C10),烷烃类及各种苯环类化合物表现一定的的催化活性。其对硝基苯、萘、二苯醚和2,4-D等多种环境毒物的催化活性预示了CYP102A16在环境污染治理领域的潜在应用价值。