蔬菜叶酸:检测技术,提高途径和基因型差异

摘要

叶酸是一种重要的水溶性B族维生素，常以多种形式存在，其英文名称除folicacid外，也被称为folate。叶酸生理功能包括参与DNA和RNA的合成;参与氨基酸代谢，在同型半胱氨酸与蛋氨酸之间的相互转化中发挥作用，因此，叶酸与人体重要的生化过程密切相关。叶酸缺乏会引起多种疾病，包括阿尔茨海默病、心血管疾病、骨质疏松症、乳腺癌和结肠癌、抑郁症、痴呆、唇腭裂、听力受损症状。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要，孕妇膳食中添加叶酸可以预防新生儿神经管缺陷。由于人类自身无法合成叶酸，因此，需要从膳食中摄取叶酸。美国食品和营养委员会推荐成年人叶酸摄取量为400μg/天，怀孕期妇女为600μg/天，哺乳期妇女为500μg/天。但调查发现大量人群叶酸摄取不足，特别是孕妇。在人体叶酸营养强化策略中，食物中天然存在的叶酸的营养强化效果明显优于药物和强化食品中人工合成的叶酸。绿叶蔬菜作为天然叶酸的主要来源，其叶酸常以多谷氨酸叶酸的形式存在。然而，目前对蔬菜中的叶酸生物强化研究相对较少。
　　 蔬菜是中国居民摄取叶酸的主要来源，用高效液相色谱方法检测蔬菜中叶酸类物质具有重要意义。本研究建立了高效液相色谱方法检测蔬菜中多谷氨酸叶酸的检测方法，具有良好的灵敏度，应用在中国市场上出售的不同种类蔬菜中叶酸类物质的检测中发现，蔬菜中的豆芽、菠菜和小白菜的叶酸含量最高。因此，本研究通过进一步研究不同品种豆类种子发芽时间对豆类叶酸及其形式的分析，以期获得最佳的发芽时间。除此外，也通过对不同品种菠菜和小白菜叶酸总量和形态的分析，研究了基因型对两种叶菜中叶酸的影响，以揭示蔬菜叶酸的遗传多样性。主要结果如下:
　　 (1)不同形式叶酸的稳定性，及低浓度是植物样品中叶酸检测的难点。因此，建立一个稳定可靠的叶酸及不同形式叶酸的分析检测技术对于蔬菜叶酸强化领域研究尤为重要。本研究通过建立快速、简便、灵敏的高效液相色谱方法应用于植物样品中叶酸的测定。该方法采用磷酸缓冲液煮沸法、添加老鼠血清(RS)轭合酶法、固相萃取柱纯化法(SPE)提取和纯化植物中的叶酸，通过ZorbaxSBC-18色谱柱分离，使用高效液相色谱（HPLC）-紫外-荧光检测器的串联法对蔬菜中的叶酸总量及不同形式叶酸（四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、10-甲酰叶酸和叶酸）进行定性和定量测定，结果表明，叶酸在范围内，峰面积与进样量呈良好线性关系，叶酸标准物质回收率高，试验重复性好。应用该方法对三种叶菜（菠菜、小白菜和生菜）的不同形态叶酸检测发现，5-甲基四氢叶酸是三种叶菜叶酸的主要形式。因此，本研究建立的叶酸检测方法是一种快速、简便、灵敏的特点，适用于植物不同形式叶酸的检测。
　　 (2)叶酸缺乏会增加人体患慢性疾病的风险，这些疾病包括婴幼儿神经管缺陷，成年人巨幼细胞性贫血，心血管疾病和某些癌症。中国是已知的神经管畸形高发区。通过足量食用新鲜的绿叶蔬菜可以减少中国人群叶酸缺乏问题，但目前对中国居民经常食用的蔬菜中总叶酸及其不同形式叶酸含量的研究较少。本研究采用高效液相色谱法对中国市场上出售的不同种类蔬菜（绿叶蔬菜、水果蔬菜、根类蔬菜）叶酸分析检测，根据结果估算以蔬菜为主要叶酸来源的中国居民膳食摄入叶酸量。结果表明，不同种类蔬菜可食部分的总叶酸含量在14.78-145.54μg/100g之间，平均含量为61.99μg/100g。其中以小白菜和菠菜的叶酸含量最高(＞140μg/100g)。绿叶蔬菜、水果蔬菜、根类蔬菜的总叶酸含量分别为17.22-145.54μg/100g、18.14-86.04μg/100g、14.78-75.81μg/100g。以上结果说明，中国居民常食用的不同类型蔬菜之间叶酸含量差异很大，总体来说，叶菜类蔬菜的叶酸含量高于水果和根茎类蔬菜。
　　 (3)叶酸缺乏和叶酸摄入量不足所导致的人体健康问题及社会经济负担问题日益受到关注。本试验研究不同发芽时间对不同品种豆类（黄豆、绿豆）种子的叶酸、维生素C、总酚和总抗氧化能力含量的影响，以期豆芽营养富集的最佳发芽时间。结果表明，发芽第4天，黄豆芽和绿豆芽叶酸含量达到最高值分别为815.2μg/100g鲜重，675.4μg/100g鲜重。相比未发芽对照，分别提高了3.5和3.9倍;超过4天之后，黄豆芽和绿豆芽的叶酸含量随之下降。5-甲基四氢叶酸是豆芽中叶酸的主要形式，并在种子发芽第4天含量最高。维生素C在未发芽对照中未检测到，发芽的第4天，黄豆芽和绿豆芽的维生素C含量达到最大值，分别达到了29mg/100g鲜重和27.7mg/100g鲜重。发芽4天的黄豆芽和绿豆芽的总叶酸、5-甲基四氢叶酸、维生素C、多酚和抗氧化能力也达到最大值。因此，本研究认为豆类发芽最适宜时间为4天。
　　 (4)叶酸生物强化为包括发展中国家在内的世界各国解决人体叶酸缺乏提供了一种成本低廉、有效的途径，该方法主要通过育种手段提高植物可食用部分叶酸含量来实现。高叶酸的种质可用于常规育种或直接作为品种利用。在蔬菜中，菠菜中叶酸含量相对较高，然而，对于不同品种菠菜中总叶酸及不同形式叶酸含量分析检测的报道较少。本研究在人工气候室统一种植条件下，种植供试67个菠菜品种（来自于美国农业部和亚洲蔬菜研究发展中心种质资源），收获后采用高效液相色谱法检测供试菠菜品种的总叶酸及不同形式叶酸含量。结果表明，菠菜总叶酸含量范围为54.1-173.2μg/100g鲜重，不同基因型之间相差约3倍，并筛选出4个高叶酸品种(PI499372，NSL6095，PI261787和TOT7337-B)，其总叶酸含量均超过150μg/100g鲜重。不同形式叶酸（四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸和叶酸）存在显著的基因型差异是造成总叶酸含量变化的原因。菠菜叶酸的主要形式是5-甲基四氢叶酸占总叶酸量的52％以上。菠菜总叶酸及不同形式叶酸含量的基因型差异为高叶酸育种研究提供了可能。
　　 (5)叶酸是生物体必需的微量营养素。然而叶酸摄入不足造成的人体叶酸缺乏的问题相当普遍。利用育种生物强化途径是解决人体叶酸缺乏具有较好前景。种质资源遗传多样性的那些样品，在遗传育种中可作为亲本被优先利用。在本研究采用高效液相色谱法对不同品种小白菜叶酸总量及其不同形式叶酸含量分析检测，研究小白菜叶酸的遗传多样性。结果表明，小白菜叶酸总量范围在52.7-166.9μg/100g鲜重之间。小白菜中不同形式叶酸（四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸和叶酸）存在显著的基因型差异造成了叶酸总量的变化。小白菜叶酸主要形式是5-甲基-四氢叶酸含量，其占总叶酸含量的54.6％，不同基因型之间相差4.5倍。对叶酸合成代谢途径中11个关键基因的表达水平研究发现，叶酸含量的变异受转录后水平的调控，故叶酸代谢基因表达的转录后调控可能是造成小白菜种质资源叶酸积累量差异的主要原因，这也是利用小白菜叶酸含量的基因型差异进行叶酸生物强化育种的遗传基础。

目录

声明

FUNDING INFORMATION

DEDICATION

Acknowledgements

Table of Contents

List of Figures

List of Tables

List of Abbreviations

Abstract

摘要

Chapter 1 General Introduction

1．1 Background Information

1．2 Project Goals

1．3 Specific Objectives

Chapter 2 Literature Review

2．1 Folate Biochemistry

2．1．1 Chemical structure and nomenclature

2．1．2 Biochemical properties

2．2 Folate Analysis

2．2．1 Sample pretreatment

2．2．2 Detection systems

2．3．Nutritional Aspects of Folate

2．3．1 Folates functions

2．3．2 Folates metabolism

2．4 Health Impacts

2．4．1 Folates deficiency

2．5 Sources of Food Folate

2．6．1 Folate biosynthesis in plant

2．6．2 Distribution of folates during plant development

2．7 Potential Strategies for Folate Biofortification

2．7．1 Exploiting the natural variation in folate levels

2．7．2 Metabolic engineering

Chapter 3 Liquid Chromatographic (LC) Determination Method of Folates in Leafy Vegetables

Abstract

3．1 Introduction

3．2 Materials and Methods

3．2．1 Chemicals and reagents

3．2．2 Folate standards

3．2．3 Enzyme preparation

3．2．4 Sample preparation

3．2．5 Sample cleanup

3．2．6 LC conditions

3．2．7 Calibration curves，limits of detection，and quantification

3．2．8 Recovery tests

3．3 Results and Discussion

3．3．1 Effects of antioxidant on folate recovery during extraction

3．3．2 Effect duration of heating at 100℃ on folate recovery during extraction

3．3．3 Effect of incubation time with folate conjugase on folate recovery during extraction

3．3．4 Effect of extraction buffer volume on folate recovery during extraction

3．3．5 Effect of the pH on folate recovery during extraction

3．3．6 Comparison of methods for enzyme treatments

3．3．7 Validation of the method

3．3．8 Folates in leafy vegetables

3．4 Conclusion

Chapter 4 Folate Content and Composition of Vegetables Commonly Consumed in China

Abstract

4．1 Introduction

4．2 Materials and Methods

4．2．1 Chemicals and reagents

4．2．2 Vegetable selection and sampling

4．2．3 Folate standards

4．2．4 Enzyme preparation

4．2．5 Sample preparation

4．2．6 Sample cleanup

4．2．7 LC conditions

4．2．8 Calibration curves，limits of detection，and quantification

4．2．9 Check of accuracy and quality control

4．2．10 Dry matter determination

4．3 Results and Discussion

4．3．1 Folate content and composition in selected Chinese vegetables

4．3．2 Contribution to recommended dietary intake

4．4 Conclusion

Chapter 5 Changes of Folate and Other Potential Health-Promoting Phytochemicals in Legume Seeds As Affected by Germination

Abstract

5．1 Introduction

5．2 Materials and Methods

5．2．1 Chemicals and reagents

5．2．2 Plant materials and experimental conditions

5．2．3 Folate analysis

5．2．4 Vitamin Canalysis

5．2．5 Determination of total phenolic compounds

5．2．6 Determination of total antioxidant capacity

5．2．7 Water content determination

5．2．8 Statistical analysis

5．3 Results

5．3．1 Folate content and composition in legume seed and sprouts

5．3．2 Vitamin C content in of legume seed and sprouts

5．3．3 Total Phenolic compounds in legume seed and sprouts

5．3．4 Total antioxidant capacity in legume seed and sprouts

5．4 Discussion

5．5 Conclusion

Chapter 6 Natural Variation of Folate Content and Composition in Spinach (Spinacia oleracea)Germplasm

Abstrac

6．1 Introduction

6．2 Materials and Methods

6．2．1 Plant materials and culture

6．2．2 Folate analysis

6．3 Results and Discussion

6．3．1 Total folate in divers spinach accessions

6．3．2 Folate vitamer distribution

6．3．3 Association of total folate content with biomass yield

6．4 Conclusion

Chapter 7 Evaluation of Genotypic Variation of Folate in Pakchoi (Brassica rapa subsp．Chinensis)Germplasm

Abstract

7．1 Introduction

7．2 Materials and Methods

7．2．1 Plant materials and culture

7．2．2 Folate analysis

7．2．3 Precursor analysis

7．2．4 Gene expression analysis

7．2．5 Statistical analysis

7．3 Results

7．3．1 Total folate in diverse pakchoi accessions

7．3．2 Folate vitamer distribution

7．3．3 Pteridine and pABA accumulation

7．3．4 Expression of genes involved in folate metabolism

7．4 Discussion

7．5 Conclusion

Chapter 8 Major Findings and Future Perspectives

8．1 Major Findings

8．2 Future Prospective

References

LIST OF PUBLICATIONS