microRNA-155调控oxLDL刺激树突细胞参与动脉粥样硬化免疫炎症反应的作用及机制

摘要

目的:
　　 利用oxLDL刺激人外周血来源DC，找出树突状细胞在oxLDL刺激后，细胞水平miRNAs全基因表达谱的变化。挑选其中变化最明显以及与动脉粥样硬化关系最密切的miR-155进行深入研究，探讨其在树突状细胞免疫炎症生物学过程中的作用机制，并找寻靶基因及其作用机制。同时明确miR-155在AS模型动物中的作用以及在冠心病不同亚型病人中变化。
　　 方法:
　　 Microarray Analysis技术筛选树突状细胞及其在oxLDL免疫炎症刺激过程中表达水平发生改变的miRNAs，运用Real-time PCR定量检测并证实相应miRNAs表达水平的改变是否与基因芯片筛选结果一致;同时检测miRNA在正常小鼠与动脉粥样硬化模型小鼠以及不同亚型型冠心病病人血清以及外周血来源PBMC中的变化，进一步锁定上述研究中变化最明显以及公认免疫炎症相关分子miR-155进行深入研究，采用miRNAs模拟物/抑制剂转染人树突状细胞并用oxLDL刺激不同时间后，检测树突状细胞分泌炎症因子的TNF-α及IL6发生的改变及MAPK信号传导通路发生的改变;另一方面，采用胆固醇包裹的agomir注射动脉粥样模型小鼠，观察其对动脉粥样硬化的进程，从体内水平观察miR-155对动脉粥样硬化免疫炎症的作用机制。并用萤火虫素酶报告基因检测验证miR-155在细胞内相对应的靶基因。同时合成靶基因MAP3K10相应的siRNA，单独转染树突细胞，观察其对免疫炎症的作用，进一步与miR-155抑制剂共转染树突状细胞观察靶基因与miRNA之间的相互作用机制。
　　 结果:
　　 MiRNA芯片结果提示树突细胞在oxLDL刺激48小时后，有100多种miRNA发生改变，其中上调有的60余种，下调的有40余种，其中以miR-155，miR-146a，miR-146b-5p，miR-29a等差异最为显著，综合实验设计和芯片结果挑选出3个最有意义的miRNA行荧光定量PCR验证，验证结果与芯片筛选完全吻合。进一步锁定miR-155进行研究，发现其在动脉粥样硬化模型小鼠中表达明显增高，在冠心病病人尤其是心梗病人血浆及PBMC中表达也明显增高，功能研究发现miR-155能减少oxLDL作用树突细胞炎症因子TNF-a，IL-6表达，抑制MAPK信号通路p38，JNK,ER磷酸化的活化，上述炎症效应同样在动脉粥样模型小鼠中得到验证，同时miR-155能够一定程度上改善动脉粥样硬化进程。生物信息学预测其靶基因是MAP3K10，荧光定量PCR以及Western-blot证明miR-155能减少MAP3K10的表达，萤火虫素酶报告基因检测验证miR-155能减少MAP3K103'UTR的表达，同时，MAP3K10对树突细胞免疫炎症效应能够被miR-155所抵消，证明其是功能相关的靶基因。
　　 结论:
　　 MiR-155在动脉粥样模型小鼠及冠心病病人中表达明显增加，miR-155能够通过靶基因MAP3K10调控动脉粥样硬化免疫炎症过程，抑制炎症因子分泌，抑制MAPK信号通路活化，并在一定程度上改善动脉粥样硬化进展。

目录

声明

致谢

前言

摘要

中英文缩略表

引言

第一部分 oxLDL激活树突细胞相关microRNA的筛选鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 MicroRNA在动脉粥样硬化不同亚型临床病人中的诊断意义

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 MicroRNA-155对oxLDL激活树突细胞生物学功能的调控及其机制

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四部分 MicroRNA-155对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化形成作用及机制

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文结论

参考文献

综述一 MicroRNA及其在心血管疾病中作用的研究进展

综述二 MicroRNA及其在动脉粥样硬化中的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果