未成熟卵体外成熟技术对小鼠肾脏肾素—血管紧张素系统基因表达和甲基化修饰的影响

摘要

目的:研究IVM小鼠肾脏RAS系统基因如Agt、Ace、Ren1、Ren2、Agtr-1a、Agtr-1b、Ace2、Agtr2和微小RNAs(Micro-RNA，MiRNAs)的表达、以及Agt和Ace的甲基化状况，阐明IVM对出生小鼠血压调控相关机制的影响。
　　材料和方法:
　　1.利用C57BL/6J小鼠，通过单纯注射孕马血清获取未成熟卵，经体外成熟培养、ICSI辅助受精和胚胎移植等方法建立IVM小鼠模型。通过注射孕马血清和人绒毛膜促性腺激素获取成熟卵，经ICSI辅助受精和胚胎移植等方法建立体内成熟小鼠模型(CON)，出生小鼠饲养至10周及1.5年时，分别处死获取两组小鼠的肾脏组织。
　　2.通过荧光定量PCR技术，检测10周及1.5年两组小鼠肾脏组织RAS基因如Agt、Ace、Ren1、Ren2、Agtr-1a、Agtr-1b、Ace2、Agtr2和miRNAs(miRNA698,miRNA27a，miRNA155和miRNA143)的表达。
　　3.利用焦磷酸测序技术检测两组小鼠两个时期肾脏组织Agt和Ace的各位点的甲基化情况。
　　4.通过western-blot技术，检测两组小鼠两个时期肾脏组织AGT、ACE、ACE2和AGTR1蛋白的表达。
　　结果:
　　1.IVM对出生后子代肾脏组织RAS系统各基因表达的影响
　　(1)10周，两组小鼠肾脏组织RAS系统各基因表达分析
　　10周时，与体内成熟小鼠相比，IVM小鼠肾脏组织Agt、Ace、Ren1、Ren2和Agtr-1b表达水平显著升高，Agtr-1a和Ace2表达水平显著下降，而Agtr-2的表达差异无统计学意义。同时，IVM小鼠肾脏组织miRNA-698、miRNA-27a和miRNA-155的表达较体内成熟小鼠显著性增高;但两组间的miRNA-143的表达差异无统计学意义。
　　(2)1.5年，两组小鼠肾脏组织RAS系统各基因表达分析
　　1.5年时，与体内成熟小鼠相比，IVM小鼠肾脏组织Agt和Ace表达水平显著升高，Ren1、Agtr-1a、Agtr-1、Ace2和Agtr-2表达水平显著下降，而Ren2的表达差异无统计学意义。同时，IVM小鼠肾脏组织miRNA-698、miRNA-27a和miRNA-143的表达较体内成熟小鼠显著增高，miRNA-155表达显著降低。
　　2.IVM对出生后子代肾脏Agt和Ace甲基化修饰影响
　　依据上述Agt及Ace的长期表达差异，选取Agt的3个甲基化位点和Ace的4个甲基化位点进行焦磷酸测序。
　　(1)10周两组小鼠肾脏组织Agt和Ace的甲基化状态分析
　　10周时，相较于体内成熟小鼠之间，IVM小鼠肾脏组织Agt的CpG2位点甲基化率显著性降低，Ace的CpG1和CpG2位点甲基化率显著性升高。而两组小鼠肾脏组织Agt及Ace其他CpG位点甲基化状态无统计学差异。
　　(2)1.5年两组小鼠肾脏组织Agt和Ace的甲基化状态分析
　　1.5年，IVM小鼠肾脏组织Ace的CpG1甲基化率低于体内成熟小鼠，差异具有统计学意义。而两组小鼠肾脏组织Agt和Ace其他CpG位点的甲基化状态没有统计学差异。
　　3.IVM对出生后子代肾脏组织AGT、ACE、ACE2和AGTR-1蛋白表达的影响
　　相较于体内成熟组，10周IVM小鼠肾脏组织AGT蛋白表达水平降低，差异有统计学意义，但到1.5年时，IVM小鼠肾脏组织AGT蛋白表达水平增高，差异具有统计学意义。而在10w和1.5y两个时间段，两组间小鼠肾脏组织ACE2、ACE2和AGTR-1蛋白表达水平无统计学差异。
　　结论:
　　1.IVM过程影响出生子代小鼠肾脏组织RAS的表达。
　　2.IVM出生子代RAS表达异常可能与其DNA甲基化水平和微小RNA表达水平相关。

目录

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致谢

序言

摘要

缩略词表

引言

材料和方法

实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 辅助生殖技术与肾素血管紧张素系统

作者简介及在读期间所取得的科研成果