细菌群体感应信号分子合成酶AmbB的结构生物学研究

摘要

随着临床上抗生素的广泛使用，细菌已出现耐药性，因此寻找新的抗感染途径已成为当今研究的热点。群体感应(quorum sensing，QS)作为细菌间传递信号的重要方式，可释放自诱导物分子来调控多种毒力因子的释放以及细菌的致病性。如今，QS已经成为新型、抗耐药菌药物设计的重要靶标，因该药物不影响细菌生长只抑制QS调控的致病行为，理论上不会引起细菌的耐药性。
　　铜绿假单胞菌是一种可引起呼吸道感染、肺炎等疾病的条件致病菌，其存在三种基于信号分子的QS系统:las、rhl和pqs系统。其中，las系统处于核心地位，它可以调控rhl和pqs的基因表达。但是，随着对铜绿假单胞菌QS系统的深入研究发现，las在群体感应调节中的核心地位并不是绝对的。研究显示非核糖体肽合成酶AmbB参与合成一种新型QS信号分子IQS，它在环境压力下（如低磷环境）取代las进而对rhl、pqs系统进行调控。本论文拟通过生物化学的方法，结合X射线晶体学的研究手段对AmbB蛋白的C端结构域进行研究，以期从结构生物学角度阐释群体感应信号分子IQS的产生机制，亦或为今后群体感应抑制剂的研发提供理论基础。
　　本研究结果包括:1.成功构建表达载体，并利用原核系统表达蛋白，已获得大量高纯度AmbBc蛋白;2.筛选到10种AmbBc晶体生长条件，经优化成功得到用于衍射的单晶;3.收集到分辨率高达2.5(A)的数据;4.成功制备重金属衍生物及硒代甲硫氨酸晶体;5.通过定点突变引入甲硫氨酸增强反常散射信号解决相位问题，目前蛋白结构已成功解析。

目录

声明

致谢

摘要

第1章 前言

1．1 细菌群体感应

1．1．1 细菌群体感应的发现

1．1．2 群体感应系统的类型

1．2 铜绿假单胞菌QS系统中AmbB的研究进展

1．2．1 铜绿假单胞菌中的群体感应

1．2．2 AmbB蛋白的研究进展

1．3 AmbB结构上属于非核糖体肽合成酶

1．3．1 非核糖体肽合成酶及其组成结构

1．3．2 NRPS的合成过程

1．3．2 NRPS的结构域特性

1．4 结构生物学

1．4．1 结构生物学简介

1．4．2 结构生物学的研究方法

1．4．3 X射线晶体学解析蛋白质结构的基本流程

1．4．4 蛋白质的结晶

第2章 实验材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 酶与药品、试剂盒

2．1．3 实验仪器

2．1．4 试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 ambB基因片段的扩增

2．2．2 重组载体的初步鉴定

2．2．3 目的蛋白的表达

2．2．4 目的蛋白的纯化

2．2．5 蛋白结晶

2．2．6 硒代甲硫氨酸晶体和重金属衍生物的制备

2．2．7 结构的解析与完善

第3章 实验结果与讨论

3．1 ambB基因的扩增与克隆

3．2 AmbBc的表达与纯化

3．2．1 AmbBc蛋白的小量表达

3．2．2 AmbBc的大量表达与纯化

3．2．3 利用AKTA凝胶过滤层析纯化AmbBe目的蛋白

3．3 AmbBc蛋白的晶体学研究

3．3．1 AmbBc蛋白结晶浓度的筛选

3．3．2 AmbBc蛋白晶体初筛

3．3．3 AmbBc蛋白晶体的优化

3．4 AmbBc蛋白晶体数据的收集与处理

3．4．1 防冻液的选择

3．4．2 数据的收集和处理

3．4．3 相位问题

3．4．4 AmbBc的整体结构

第4章 小结与展望

参考文献

附录A

作者简历及在校期间取得的科研成果