不同锌源对猪肠上皮细胞IPEC-1锌吸收转运蛋白基因水平的影响

摘要

本试验以猪肠上皮细胞IPEC-1为实验模型，研究了三种锌源（甘氨酸锌、蛋氨酸锌、硫酸锌）对IPEC-1锌吸收转运蛋白基因水平的影响。并通过RNA干扰，研究ZIP4在肠道锌转运过程中发挥的作用，进一步探讨氨基酸螯合锌在猪肠道的可能吸收模式。试验分以下两部分进行:
　　试验一 不同锌源和锌水平对IPEC-1锌吸收转运蛋白基因表达的影响
　　1.不同锌源对猪肠上皮细胞IPEC-1细胞增殖的影响
　　试验以IPEC-1为研究对象，分别在IPEC-1细胞培养液中添加锌浓度为0、50、100、150、200μmol/L的三种锌源（甘氨酸锌、蛋氨酸锌、硫酸锌）分别培养6h、12h、24 h，MTT法测定细胞增殖变化。结果表明:在作用6h、12h或24 h后，高剂量的三种锌源均显著抑制猪肠上皮细胞的生长（P＜0.05），其中以6h时细胞活性值的下降幅度最小，但高剂量（100μmol/L以上）同浓度的有机锌对IPEC-1细胞的损伤小于无机锌。同时甘氨酸锌、蛋氨酸锌、硫酸锌组IPEC-1细胞活性具有明显的剂量依赖效应，随着锌浓度的增加细胞活性下降，并且在锌添加水平≥100μmnol/L时下降明显。因此本试验选择50μmol/L、6h作为最佳处理浓度和时间用于后期试验。
　　2.不同锌源对猪肠上皮细胞IPEC-1锌吸收转运蛋白基因水平的影响
　　选用锌浓度为50μmol/L的三种锌源（甘氨酸锌、蛋氨酸锌、硫酸锌）或锌浓度为0、50、100、200μmol/L的甘氨酸锌分别作用于IPEC-1细胞，处理6h。Real-time PCR法测定MT1、DMT1、ZIP4、ZIP5、ZnT1、ZnT2 mRNA表达水平，以β-actin mRNA水平作为内参对照。结果表明:三种锌源均可快速有效改善细胞锌状态。添加锌可显著上调IPEC-1细胞MT1、ZIP5、ZnT1和ZnT2 mRNA表达水平（P＜0.05），下调ZIP4 mRNA表达水平(P＜0.05)，但三种锌源处理组组间差异显著。与对照组相比，甘氨酸锌组能较显著地上调MT1、DMT1、ZnT1mRNA表达水平（P＜0.05）;硫酸锌和蛋氨酸锌组ZnT2 mRNA表达水平显著增加（P＜0.05），DMT1、ZIP4 mRNA表达水平均显著下降（P＜0.05）;硫酸锌组ZIP5 mRNA表达水平显著增加(P＜0.05)，其他各组差异不显著（P＞0.05）。同时添加不同水平的甘氨酸锌处理IPEC-1细胞6h后，MT1、ZIP5、ZnT1、ZnT2mRNA表达水平显著增加(P＜0.05)，ZIP4 mRNA表达水平显著下降（P＜0.05）。添加锌浓度为50μmol/L的甘氨酸锌可显著增加DMT1 mRNA表达水平（P＜0.05），而高浓度锌添加量（100、200μmol/L）均显著降低其表达水平(P＜0.05)。
　　试验二 ZIP4-siRNA转染对IPEC-1 MT1、DMT1 mRNA表达及细胞锌吸收率的影响
　　以猪肠上皮细胞IPEC-1为研究对象，设计合成针对ZIP4基因的siRNA，经LipofectamineTM2000脂质体转染IPEC-1细胞24 h、48 h，RT-PCR法检测ZIP4mRNA水平表达的变化，并用MTT法检测IPEC-1细胞增殖的变化;添加50μmol/L硫酸锌、甘氨酸锌、蛋氨酸锌分别处理ZIP4-siRNA转染细胞6h，RT-PCR法检测MT1、DMT1 mRNA表达变化，ICP-MS法检测IPEC-1细胞锌吸收率的变化。研究结果表明:
　　(1)4对ZIP4-siRNA序列转染IPEC-1细胞24 h或48 h可有效抑制ZIP4 mRNA表达，其中ZIP4-siRNA1序列抑制效果更明显。与空白对照组相比，24 hZIP4-siRNA1抑制率达到64.60％;48 h干扰效果更加突出，抑制率达到78.43％。同时MTT结果显示，ZIP4-siRNA1转染IPEC-1细胞24 h或48 h对细胞MTT OD值无显著影响（P＞0.05）。因此，本试验选取ZIP4-siRNA1和24 h分别作为最佳特异性RNA干扰序列和干扰时间。
　　(2)不同锌源作用IPEC-1转染细胞6h发现:添加硫酸锌和甘氨酸锌的转染组MT1 mRNA表达水平较阴性对照组分别下降了16.94％(P＜0.05)、33.62％（P＜0.05），但添加蛋氨酸锌的转染组MT1 mRNA表达水平与阴性对照组差异不显著（P＞0.05）。与阴性对照组相比，添加硫酸锌的转染组DMT1 mRNA表达水平提高了29.61％（P＞0.05），而添加甘氨酸锌和蛋氨酸锌的转染组DMT1 mRNA表达水平分别下降了29.85％(P＜0.05)、26.44％(P＜0.05)。添加硫酸锌作用6h后，ZIP4-siRNA转染组IPEC-1细胞锌吸收率较阴性对照组下降了73.33％（P＜0.05），但ZIP4-siRNA转染前后对甘氨酸锌和蛋氨酸锌组细胞锌吸收率影响不显著（P＞0.05）。
　　综上所述，添加甘氨酸锌、蛋氨酸锌或硫酸锌均可快速有效改善细胞锌状态;高剂量的三种锌源均可抑制猪肠上皮细胞增殖，但高剂量（锌浓度≥100μmol/L）同浓度的有机锌对猪肠上皮细胞的损伤小于无机锌;三种锌源对肠道锌吸收转运蛋白基因的表达存在差异，甘氨酸锌组能够较显著地上调MT1、DMT1、ZnT1mRNA表达水平，硫酸锌和蛋氨酸锌组ZnT2 mRNA表达水平显著增加，DMT1、ZIP4 mRNA表达均显著下降，硫酸锌组ZIP5 mRNA表达水平显著高于其他各组。添加不同水平的甘氨酸锌可显著上调MT1、ZIP5、ZnT1、ZnT2 mRNA表达水平，下调ZIP4 mRNA表达水平。RNAi实验进一步证实硫酸锌在肠道的吸收主要依赖ZIP4，甘氨酸锌部分依赖ZIP4，蛋氨酸锌基本不依赖ZIP4。推测有机锌可能与无机锌的吸收转运方式不同，在肠细胞顶膜侧可能存在其他吸收通路，对此有待进一步深入研究。

目录

声明

致谢

主要英文缩略词

摘要

第一章 文献综述

1．1 锌的生物学作用

1．1．1 维持酶的活性与功能

1．1．2 锌与动物生长

1．1．3 锌与动物免疫

1．1．4 锌与动物繁殖

1．2 锌的吸收与转运

1．2．1 锌的吸收方式

1．2．2 常见锌转运蛋白

1．3 氨基酸螯合锌

1．3．1 氨基酸螯合锌的概念

1．3．2 氨基酸螯合锌的营养特性

1．3．3 氨基酸螯合锌在生产中的应用

1．3．4 氨基酸螯合锌吸收假说

1．4 RNA干扰

1．5 研究目的、意义与内容

1．5．1 研究目的与意义

1．5．2 研究内容

第二章 不同锌源和锌水平对IPEC-1锌吸收转运蛋白基因表达的影响

第一节 不同锌源对猪肠上皮细胞(IPEC-1)细胞增殖的影响

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二节 不同锌源和锌水平对IPEC-1锌吸收转运蛋白基因表达的影响

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 ZIP4-siRNA转染对IPEC-1细胞锌吸收转运的影响

3．1 试验材料

3．1．1 细胞株和siI矾A来源

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．2 试验方法

3．2．1 IPEC-1细胞培养

3．2．2 设计与合成siRNA序列

3．2．3 IPEC-1细胞转染

3．2．4 不同位点ZIP4-siRNA的mRNA表达检测

3．2．5 ZIP4-siRNA转染对IPEC-1细胞增殖的影响

3．2．6 ZIP4-siRNAl转染对IPEC-1细胞内MT1、DMT1 mRNA表达的影响

3．2．7 ZIP4-siRNAl转染对IPEC-1细胞锌吸收率的影响

3．2．8 数据处理

3．3 结果

3．3．1 不同位点ZIP4-siRNA转染对ZIP4 mRNA表达的影响

3．3．2 ZIP4-siRNA转染对IPEC-1细胞增殖的影响

3．3．3 不同锌源对IPEC-1转染细胞MT1、DMT1 mRNA表达的影响

3．3．4 ZIP4-siRNAl转染对IPEC-1细胞锌吸收率的影响

3．4 讨论

第四章 小结与创新点

4．1 小结

4．2 创新点

参考文献