CRISPR-Cas9技术构建LCA-Nmnat1小鼠动物模型及其发病机理研究和PHEX基因新发嵌合突变导致低磷酸盐血症性佝偻病

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一部分 CRISPR-Cas9技术构建LCA-Nmnat1小鼠动物模型及其发病机理研究
　　遗传性疾病是出生缺陷的重要原因，单纯性眼科遗传病近300种，其中先天性黑蒙症(Leber's congenital amaurosis，LCA)是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变。目前已发现18种与LCA相关的致病基因，我们课题组运用外显子组捕获和新一代高通量测序的方法，发现NMNA T1基因突变可以导致第9型先天性黑蒙症。但是具体的突变致病机制未知。
　　从生物信息学分析、细胞学分析以及CRISPR-Cas9构建定点突变小鼠动物模型三方面探究突变可能的致病机理。生物信息学分析包括人和小鼠NMNAT1蛋白同源性分析，确保以小鼠作为动物模型的可信性;蛋白晶体结构分析，找到最可能影响蛋白结构的位点作为突变研究对象;蛋白质相互作用分析，探索与NMNAT1相互作用的蛋白。细胞学分析方面构建8种突变和一种野生型重组质粒，进行荧光共聚焦和荧光定量实验，探究突变对亚细胞定位和对RNA水平的影响，后续将进一步进行蛋白质水平的Western Blot实验。CRISPR-Cas9构建小鼠动物模型方面，已获得用于显微注射的gRNA、Cas9 mRNA和模板DNA，已购买和饲养供体鼠(C57)和受体鼠(ICR)，获得动物模型后将从表型、生化分析、细胞分子水平等方面全面探索致病机制，并且探寻可行的治疗方法。
　　人和小鼠NMNAT1蛋白质高度同源。蛋白晶体结构分析缬氨酸151(V151)位于蛋白的疏水核心，缬氨酸98(V98)接近配体结合位点，Trp85*(M255)以及Trp169*(M507)无义突变蛋白明显截短，结构分散。蛋白质相互作用预测其与多种蛋白存在可能的相互作用。荧光共聚焦实验结果显示Trp85*亚细胞定位有明显逸散出细胞核的现象，其他突变亚细胞定位无异常。荧光定量实验显示Trp85*(M255)、Trp169*(M507)无义突变体以及Met35Thr(M104)、Leu153Val(M457)错义突变体RNA水平和野生型差别不大，而Val151Phe(M451)错义突变体RNA水平显著下降。CRISPR-Cas9构建小鼠动物模型方面，已经准备好注射用的RNA和模板DNA。
　　本研究拟从生物信息学、细胞生物学、分子生物学、生物化学、组织和器官等多角度阐明NMNAT1突变和先天性黑蒙症的关系。目前进展顺利，已完成前期工作，包括生物信息学分析，细胞生物学的部分分析和CRISPR-Cas9构建小鼠动物模型前面部分，后续将进一步探究突变的致病机制，以及利用药物治疗和基因治疗手段研究治疗先天性黑蒙症的可行性，为临床研究和治疗奠定理论基础。
　　第二部分 PHEX基因新发嵌合突变导致低磷酸盐血症性佝偻病
　　X连锁显性低磷酸盐血症性佝偻病(MIM＃307800)，是一种遗传性骨病。主要表现为肾小管对磷酸盐的重吸收异常、发育迟缓、身材矮小、骨骼疼痛、牙釉质异常、双下肢畸形、行走无力，X射线提示佝偻病症状。该病是由位于X染色体p22.1-22.2上PHEX基因突变造成。在本研究中，我们诊断出一个患病男孩，其PHEX基因看似杂合，我们拟探寻具体的致病机制。虽然患者是一名男孩，Sanger测序显示其X染色体上的PHEX基因有表象上杂合突变，存在双峰，一个是正常的碱基“G”，另一个是“A”。TA克隆测序表明确实存在这两种碱基，并且获得了大致的比率。之后我们用生物信息学工具预测以及外显子捕获技术实验验证该剪切位点突变对RNA剪切的影响。荧光定量PCR实验用以检测PHEX的基因拷贝数。TA克隆测序实验显示正常碱基G和突变碱基A的频率比为19∶13。染色体核型分析结果显示病人核型正常，荧光定量PCR检测基因拷贝数的结果验证了核型分析的结果。这个剪切突变将会引起外显子18中4个碱基丢失，造成移码突变，蛋白截短，PHEX蛋白的激活位点和Zn2+结合位点丧失，因此造成肾小管重吸收障碍和骨骼矿化异常。总之，发生在保守剪切位点的突变将会造成异常的剪切，形成功能受损的蛋白。我们发现的新发突变是一个嵌合突变，可能发生于前期受精卵阶段。本研究对于之后进行X连锁显性低磷酸盐血症性佝偻病的遗传咨询时考虑嵌合突变起到重要的提示作用。

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摘要

第一部分 CRISPR-Cas9技术构建LCA-Nmnat1小鼠动物模型及其发病机理研究

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论与小结

参考文献

第二部分 PHEX基因新发嵌合突变导致低磷酸盐血症性佝偻病

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 精准医疗浅谈

作者简介及在读期间所取得的科研成果