植物PG基因进化的研究与白菜雄蕊发育相关的两个PG基因的表达分析和功能鉴定

摘要

被子植物的花通常由雌蕊、雄蕊、花瓣和萼片四轮花器官组成，其中雄蕊和雌蕊的精确发育决定了植物的育性。雄蕊发育涉及一系列以细胞壁的降解和松弛为前提的细胞扩张与细胞分离事件。果胶是双子叶植物初生细胞壁的主要成分，同时也是花粉内壁和花粉管壁的重要组成成分。果胶的合成和降解涉及一系列酶的参与。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases，PGs)是重要的果胶水解酶之一，它参与到了果实成熟、器官脱落、花粉成熟等过程，对植物的生长发育具有重要意义。PG属于植物最大的水解酶家族之一。然而，至今人们对PG家族的科学分类仍缺乏共识，对禾本科和双子叶植物中PG家族结构上的差异的根本原因仍不清楚。激素能调控雄蕊发育，那么雄蕊发育相关的PG基因是否受到了激素的调控表达，受到哪些植物激素的影响？这些问题都值得我们探讨。此外，目前对PG基因在雄蕊发育过程中的功能鉴定的研究仍非常有限，需要我们进一步挖掘更多与雄蕊发育密切相关的PG基因，并鉴定其功能。本研究针对以上问题，分析了白菜PG基因家族成员的进化，比较了PG基因在禾本科和双子叶植物间进化和表达的异同，筛选了与雄蕊发育相关的拟南芥PG基因，并研究了它们在雄蕊发育过程中的表达动态及其受植物激素的影响，分析了白菜两个雄蕊发育相关PG基因的表达和生物学功能。主要研究结果与结论如下:
　　(1)通过邻接法对包括白菜在内的5个陆生植物物种的269个PG基因构建联合系统发生树，并进一步统计分析不同分枝PG的基因序列特征，估算PG基因编码序列的进化速率、启动子变异以及该两者的相关性，结果表明，植物PG家族能被划分为7类，不同类别PG基因在序列特征、进化速率、启动子变异有其分支特异性。对启动子变异与编码序列进化速率的回归分析结果表明，启动子的进化与基因编码序列的进化密切相关。不同于其他分支成员，Clade A和Clade E的蛋白进化较慢、启动子变异却很大，倾向于遍在表达，它们可能具有古老的起源。对白菜PG基因按照表达模式进行聚类后，我们发现，不同分支成员在表达上存在偏向性，其中，Clade C、D和F倾向于在生殖器官中表达，对植物生殖发育具有重要意义。此外，表达分析结果也暗示剂量效应是白菜重复PG基因保留的主要原因。
　　(2)通过比较氨基酸序列相似性和分析保守结构域，在5种禾本科植物（二穗短柄草、谷子、高梁、水稻和玉米）和5种双子叶植物（拟南芥、大豆、苜蓿、杨树和蓖麻）中一共鉴定出577个PG基因。进化分析结果显示，禾本科和双子叶植物的PG基因家族在基因重重和丢失模式以及进化速率上存在明显差异。禾本科植物Clade C和Clade F的PG基因的数量明显少于双子叶植物。我们发现造成这种差异的主要原因是禾本科植物PG家族整体经历了较少的基因重复和较多的基因丢失。不论是在双子叶植物还是禾本科植物中，Clade D和Clade E都发生了较其他大部分分支多的基因重复。利用已有的基因芯片数据，我们对大豆、苜蓿、水稻、玉米和杨树PG家族成员的表达分析结果显示，在这两大类物种中，Clade E成员都具有整体较高的表达量、并在各个组织遍在表达，而Clade D的成员可能与雄性生殖密切相关，表明它们的功能在禾本科和双子叶植物中都非常保守。Clade C和Clade F成员除了可能在两类物种的生殖发育中发挥作用外，它们还可能特异地在双子叶植物根的发育中扮演重要角色。
　　(3)基于拟南芥芯片数据，筛选出14个雄蕊发育相关的PG基因。系统发生分析结果表明，雄蕊发育相关的PG基因中绝大多数属于PG家族的Clade D，还有来自除Clade A以外的其他分支的成员。对该14个PG基因启动子元件的分析结果表明，这些基因可能主要受到生长素和赤霉素的调控表达。进一步构建这14个基因的启动子-GUS融合表达载体并转化拟南芥。对筛选获得的阳性转化株的组织化学染色分析结果显示，绝大多数雄蕊发育相关PG基因都在绒毡层和成熟花粉粒中表达。对经过赤霉素或生长素处理的拟南芥转化株幼苗的观察结果表明，赤霉素和生长素能够调控雄蕊发育相关PG基因在幼苗中的表达。
　　(4)基于大白菜数据库BRAD的基因组信息，通过克隆得到BrPG22-1和BrPG22-2的DNA和cDNA全长。序列比对分析结果显示，BrPG22-1和BrPG22-2的氨基酸序列相似性高达92.0％。跨膜结构域预测和亚细胞定位分析结果表明，该两个基因是典型的分泌蛋白。半定量和启动子-GUS融合表达系统的分析结果显示，BrPG22-1和BrPG22-2主要在早期的雄蕊中表达，BrPG22-1还在花丝和胚囊中表达，表明BrPG22-1可能经历了新功能化。通过反义RNA技术抑制该两个基因的表达后，转基因植株的花器官形态、花粉形态和花粉活力与对照株相比没有明显差异，表明可能存在其他PG基因与BrPG22-1和BrPG22-2功能冗余。

目录

声明

致谢

缩略词

摘要

前言

1 文献综述：植物雄蕊发育与PG基因的研究进展

1．1 雄蕊的发育与调控

1．1．1 雄蕊的结构及发育

1．1．2 雄蕊发育调控的研究

1．2 植物细胞壁果胶的研究进展

1．2．1 果胶的结构和作用

1．2．2 细胞壁果胶的含量与分布

1．2．3 果胶代谢的研究

1．3 植物多聚半乳糖醛酸酶的研究进展

1．3．1 PG的序列和结构特征

1．3．2 PG的调控

1．3．3 PG的生物学功能

1．3．4 PG基因家族的进化

2 白菜多聚半乳糖醛酸酶基因家族成员的分子进化

2．1 材料与方法

2．1．1 白菜PG基因的系统发生分析与命名

2．1．2 白菜PG基因的特征性鉴定

2．1．3 基因编码序列的进化分析

2．1．4 启动子序列的变异分析

2．1．5 PG家族成员的表达分析

2．1．6 荧光实时定量PCR分析

2．2 结果

2．2．1 白菜PG家族成员的系统发生分析与命名

2．2．2 白菜PG的序列特征

2．2．3 白菜PG基因编码序列和启动子的进化分析

2．2．4 白菜PG家族成员的表达分析

2．3 讨论

2．3．1 植物PG基因的科学分类和复杂的分子进化

2．3．2 白菜PG基因启动子的变异与编码序列的进化密切相关

2．3．3 白菜不同类别PG基因的表达具有偏向性

2．3．4 剂量效应促进了白菜重复PG基因的保留

3 禾本科与双子叶植物PG基因进化的比较分析

3．1 材料与方法

3．1．1 PG基因的鉴定、系统发生和分布统计分析

3．1．2 PG基因的重复和丢失估算

3．1．3 PG基因的选择压分析

3．1．4 PG基因的表达分析

3．1．5 顺式调控元件分析

3．2 结果

3．2．1 禾本科和双子叶植物PG基因的鉴定、系统发生和分布

3．2．2 禾本科和双子叶植物PG基因的重复和丢失模式

3．2．3 禾本科和双子叶植物PG基因的选择压分析

3．2．4 禾本科和双子叶植物PG基因的表达模式分析

3．2．5 Clade C和Clade F类PG基因的顺式调控元件分析

3．3 讨论

3．3．1 禾本科和双子叶植物间PG基因进化的差异性和相似性与细胞壁果胶的类型有关

3．3．2 保守而多样的PG基因功能及其与禾本科和双子叶植物器官差异的联系

3．3．3 对特定诱因的响应能力促进了PG基因的扩张和保留

4 拟南芥雄蕊发育相关PG基因的表达动态及其受植物激素的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 拟南芥雄蕊发育相关PG基因的筛选和系统发生分析

4．1．2 植物材料与主要试剂

4．1．3 拟南芥基因组DNA的提取

4．1．4 启动子序列的克隆

4．1．5 启动子激素响应相关元件的分析

4．1．6 启动子-GUS融合表达载体的构建和农杆菌转化

4．1．7 启动子表达载体的拟南芥转化

4．1．8 拟南芥阳性转化植株的筛选

4．1．9 组织化学染色观察

4．1．10 激素处理

4．2 结果

4．2．1 雄蕊发育相关PG基因的筛选和系统发生分析

4．2．2 14个拟南芥雄蕊发育相关PG基因启动子中包含生长素和赤霉素响应的元件

4．2．3 获得的雄蕊发育相关PG基因的启动子均能启动GUS基因在拟南芥转化株中表达

4．2．4 外施生长素和GA能够影响拟南芥雄蕊发育相关PG基因在幼苗中的表达

4．3 讨论

4．3．1 雄蕊发育受到了主要来自Clade D成员的不同类别PG基因的作用

4．3．2 PG不仅间接影响花粉发育而且直接影响成熟花粉粒内壁的成层

4．3．3 生长素和GA可通过调控PG的表达而影响雄蕊发育

4．3．4 至少部分参与雄蕊发育的PG基因也在其他植物生长发育过程起作用

5 白菜雄蕊发育相关PG基因BrPG22-1和BrPG22-2的表达分析与功能鉴定

5．1 材料与方法

5．1．1 植物材料与主要试剂

5．1．2 白菜核不育两用系‘Bcajh97-01A／B’的人工授粉

5．1．3 DNA、总RNA的提取与cDNA的合成

5．1．4 基因序列、过表达片段及启动子序列的克隆

5．1．5 核苷酸序列分析

5．1．6 基因的时空表达分析

5．1．7 BrPG22-1和BrPG22-2启动子融合表达载体的构建和农杆菌转化

5．1．8 BrPG22-1和BrPG22-2启动子表达载体的拟南芥转化和筛选

5．1．9 BrPG22-1和BrPG22-2的启动子表达载体的拟南芥表达分析

5．1．10 亚细胞定位分析

5．1．11 反义表达载体的构建

5．1．12 反义表达载体对菜心的遗传转化

5．1．13 转反义基因植株的分子检测

5．1．14 转反义基因植株的形态学与细胞学观察

5．2 结果

5．2．1 BrPG22-1和BrPG22-2的序列和结构特征

5．2．2 BrPG22-1和BrPG22-2具有部分重叠但明显不同的表达模式

5．2．3 BrPG22-1和BrPG22-2编码的蛋白定位于细胞质和细胞壁

5．2．4 反义BrPG22-1／BrPG22-2 表达载体成功导入菜心植株

5．2．5 BrPG22-1／BrPG22-2在brpg22花序中的表达受到抑制

5．2．6 brpg22的花器官形态、花粉发育和花粉管生长正常

5．3 讨论

5．3．1 BrPG22-1和BrPG22-2是与早期的雄蕊发育相关的PG基因

5．3．2 BrPG22-1经历了新功能化从而促进其保留

5．3．3 可能存在其他PG家族成员与BrPG22-1和BrPG22-2功能冗余

结论

参考文献

附表

在读期间发表的论文