基于多相分类学及基因组学的褐藻降解细菌的资源开发及降解机制研究

摘要

海洋是一个极其复杂但至关重要的生态系统，广阔的海域面积孕育着数不胜数的海洋生物。在整个生态系统中，海洋微生物既扮演生产者又充当消费者和分解者，是海洋中最重要的生态组成。同时，海洋环境的特殊与多变，也造就了丰富多彩的海洋微生物和他们多种多样的功能。其中，褐藻降解细菌因其原材料——褐藻的优良应用潜力，具有不同于其他海洋细菌的重要研究意义。本论文针对褐藻降解细菌的分离、多相分类学鉴定、发酵条件优化、基因组测序及褐藻降解机制分析等研究工作展开，研究了褐藻降解细菌的菌株特性、分类地位、发酵工艺以及降解机制等，为褐藻及褐藻降解细菌的深入开发利用提供了研究基础。
　　首先，采集了来至于南海海域与舟山海域的6个不同类型样品，进行了褐藻降解细菌的分离及降解能力检测，共分离得到39株细菌（疑似新种4株），分属29个属，其中具有褐藻降解能力的菌株16株，得出褐藻分布丰度高的海域样品以及针对性的分离方法有助于褐藻降解细菌分离的结论。
　　其次，针对分离得到的疑似新种进行了多相分类学鉴定，建立了1个新属(Pseudoroseovarius gen.nov.)和2个新种（Thalassomonas eurytherma sp.nov.和Algibacter alginolytica sp.nov.），其中Algibacter alginolytica sp.nov.为褐藻降解细菌新种，并对Roseovarius属内的Roseovarius crassostreae，Roseovariussediminilitoris和Roseovarius halocynthiae进行了重新分类，归至新属Pseudoroseovarius。
　　再次，研究了褐藻降解细菌Microbulbifer elongates功能菌株HZ11的褐藻降解能力，进行了菌株HZ11菌株特性的鉴定、生产大量海藻酸钠寡糖方式的确定、最佳发酵产酶条件的确定、粗酶液酶学性质的检测和5L水平发酵罐验证等研究，得到了利用菌株HZ11生产大量海藻酸钠寡糖的工业发酵方法。
　　然后，针对褐藻降解细菌Microbulbifer elongates的功能菌株HZ11进行全基因组学研究，得到了仅含9个contig的基因组高质量草图。对于预测得到的基因进行了COG、KEGG数据库功能分类，从功能基因分布情况证明了菌株HZ11对于多糖代谢的偏好性。针对菌株HZ11的糖类活性酶（海藻酸钠裂解酶、琼胶酶和糖结合位点）进行了家族分类，分析得到各糖类活性酶可能的底物偏好，预测了海带中主要可发酵物质（海藻酸钠、海带淀粉和甘露醇）在菌株HZ11中可能代谢通路及菌株HZ11乙醇生产相关酶，在基因组水平证明了菌株HZ11具有利用海藻酸钠发酵生产乙醇的潜力。
　　最后，对褐藻降解细菌Algibacter alginolytica内菌株HZ22进行全基因组学研究和褐藻降解机制研究，得到了菌株HZ22基因组的成环完成图。精细预测并分析了菌株HZ22的糖类活性酶CAZyme，得到了菌株HZ22中所有CAZyme的位置分布、CAZyme的家族分类以及菌株可能降解多糖对应的CAZyme，并根据结果预测了菌株HZ22的可降解多糖。预测得到17个的多糖利用位点PUL，给出PUL对应的降解底物，并预测及分析了PUL中的转运及调控系统，同时，还讨论了海藻酸钠特异性的PULN和PUL Q的结构特点及关联。

目录

声明

摘要

图表目录

1 第一章绪论

1．1 海洋微生物概述

1．2 多相分类学概述

1．2．1 表型特征

1．2．2 基因型特征

1．2．3 细菌多相分类学的未来发展

1．3 褐藻(海带)及其主要组成成分概述

1．3．1 褐藻(海带)

1．3．2 海藻酸钠

1．3．3 褐藻糖胶

1．3．4 褐藻淀粉

1．4 褐藻降解细菌的研究意义

1．4．1 生物能源与褐藻生物质能转化概述

1．4．2 海藻酸钠寡糖概述

1．5 褐藻降解细菌的研究进展

1．5．1 海藻酸钠裂解酶的研究进展

1．5．2 细菌降解海藻酸钠的途径及机制研究

1．5．3 基于全基因组的褐藻降解细菌降解机制研究

1．5．4 利用褐藻降解细菌生产乙醇的研究进展

1．6 本研究目的、意义与内容的概述

2 第二章褐藻降解细菌的分离

2．1 材料与方法

2．1．1 样品采集

2．1．2 菌株分离与培养

2．1．3 菌株16S rRNA基因序列分析

2．1．4 菌株褐藻降解能力测定

2．2 实验结果

2．2．1 菌株分离结果

2．2．2 不同菌株褐藻降解能力测定的结果

2．3 本章小结及讨论

3 第三章细菌疑似新种的多相分类学鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株分离与培养

3．1．2 多相分类学鉴定

3．2 结果与讨论

3．2．1 菌株Za6a-12T与Za6a-17的多相分类学鉴定结果

3．2．2 菌株JB3T的多相分类学鉴定结果

3．2．3 菌株HZ22T的多相分类学鉴定结果

3．3 本章小结

4 第四章利用菌株HZ11生产海藻酸钠寡糖的工艺优化

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株HZ11的简单鉴定

4．1．2 菌株HZ11生产海藻酸钠寡糖的不同方法比较

4．1．3 菌株HZ11产酶条件的优化

4．1．4 菌株HZ11粗酶液处理海带条件的优化

4．1．5 菌株HZ11生产海藻酸钠寡糖的5L小试发酵

4．2 实验结果及讨论

4．2．1 菌株HZ11的特性

4．2．2 菌株HZ11生产海藻酸钠寡糖的最佳方法

4．2．3 菌株HZ11的最佳产酶条件

4．2．4 菌株HZ11粗酶液性质及处理海带的最佳条件

4．2．5 菌株HZ11生产海藻酸钠寡糖的5L小试发酵结果

4．3 本章小结

5 第五章菌株HZ11的全基因组测序及分析

5．1 材料与方法

5．1．1 细菌全基因组的抽提及质量控制

5．1．2 基因组测序及拼接补洞

5．1．3 基因组注释与分析

5．1．4 菌株HZ11中海藻酸钠裂解酶的CAZy家族分类

5．1．5 菌株HZ11中海带主要可发酵物质的代谢通路预测

5．2 菌株HZ11的基因组分析结果

5．2．1 基因组抽提结果

5．2．2 基因组特征

5．2．3 基因组注释与分析结果

5．2．4 菌株HZ11中海藻酸钠裂解酶的CAZy家族分类结果

5．2．5 菌株HZ11中海带主要可发酵物质的代谢通路

5．3 本章小结及讨论

6 第六章菌株HZ22基于全基因组的褐藻降解机制分析

6．1 材料与方法

6．1．1 细菌全基因组的抽提及质量控制

6．1．2 基因组测序及拼接补洞

6．1．3 基因组注释与分析

6．1．4 CAZyme的预测及分析

6．1．5 PUL的预测及分析

6．1．6 菌株HZ22粗酶液的酶学性质测定

6．2 菌株HZ22的基因组分析结果

6．2．1 基因组特征

6．2．2 基因组基本注释与分析结果

6．2．3 能量代谢相关基因预测结果

6．2．4 CAZyme的预测及分析结果

6．2．5 PUL的预测及分析结果

6．2．6 菌株HZ22粗酶液的酶学性质

6．3 本章小结及讨论

7 第七章总结与展望

7．1 总结

7．2 展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文和专利

致谢