CYP2C亚家族组织特异性表达模式中的表观遗传学调控机制

摘要

CYP2C亚家族是细胞色素P450酶(Cytochrome P450)的重要组成部分，编码表达药物代谢酶CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，其组织特异性表达模式明显，主要在肝脏表达，CYP2C19在十二指肠有少量表达。肝脏特异性的核转录因子是目前已阐明的CYP2C亚家族转录表达的重要调控因素。此外，研究发现，在肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）肿瘤组织中CYP2 C8，CYP2C9及CYP2C19基因的转录水平和蛋白表达水平相对于癌旁组织显著降低，说明CYP2C亚家族成员的表达水平变化与HCC肿瘤发生也有一定关联，但具体机制尚未明了。表观遗传学广泛参与基因的表达调控，在细胞分化、肿瘤形成、机体发育等生命进程中发挥着重要的作用。DNA甲基化、组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化是目前研究得最多的表观遗传调控机制。研究表观遗传机制在CYP2C亚家族组织特异性表达中的作用，是对CYP2C亚家族调控网络的重要补充。
　　在本研究中，我们首先通过分析不同组织的全基因组亚硫酸氢盐测序(Wholegenome bisulfite sequencing，WGBS)和染色质免疫共沉淀测序(Chromatinimmunoprecipitation sequencing，ChIP-seq)数据，挖掘出了CYP2C亚家族转录起始位点附近CpG位点的甲基化水平，在肝脏组织中要明显低于其他组织;对于组蛋白修饰，肝脏CYP2C8和CYP2C9启动子的H3K9ac和H3K27ac修饰要显著高于其他组织;肝脏CYP2C19启动子的乙酰化修饰水平较低，与其他组织之间的差异不如CYP2 C8和CYP2C9显著。这些差异甲基化或乙酰化修饰的位点可能与CYP2C亚家族组织特异性表达有关。
　　为了考察DNA甲基化和组蛋白乙酰化对CYP2C亚家族的调控作用，我们分别用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TricostatinA，TSA)和DNA甲基化酶抑制剂5-aza-dC（5-Aza-2'-deoxycytidine）处理原代肝脏细胞，发现在原代肝脏细胞中，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19都能受到不同程度地诱导。此外，在5-aza-dC作用下，CYP2C亚家族重要的转录因子中的组成性雄甾烷受体(Constitutiveandrostane receptor，CAR)相应地也受到诱导上调。进一步考察给药组和对照组细胞的DNA甲基化修饰状况发现，给药组细胞基因组中CYP2C亚家族成员启动子和CAR启动子区域DNA甲基化水平降低，这证实，在正常肝脏中，组蛋白乙酰化和DNA甲基化是CYP2C亚家族转录调控的可能机制，CAR在DNA甲基化调控CYP2C亚家族成员表达的过程中起着一定作用。
　　在此基础上，我们接着研究HCC中CYP2C亚家族表达抑制是否与DNA甲基化有关。实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测发现，肿瘤组织中CYP2C亚家族成员和CAR的表达水平相对于癌旁组织显著降低。亚硫酸氢盐PCR(Bisulfite sequencing PCR，BSP)发现，CYP2C亚家族成员启动子甲基化水平在肿瘤和癌旁组织中不存在差异，但CAR转录起始位点(Transcriptional startsite，TSS)附近e-box的CpG位点甲基化水平存在显著差异，这一位点的甲基化水平与CYP2C亚家族和CAR的表达水平呈反相关。报告基因实验进一步证实该位点甲基化水平升高可抑制CAR的表达，从而间接抑制下游CYP2C亚家族的表达。
　　接着，我们又考察了组蛋白乙酰化是否也是HCC中CYP2C亚家族表达水平下降的因素。ChIP结果显示，在肿瘤组织中，CYP2C8和CYP2C9启动子的H3K9ac和H3K27ac水平显著降低;而CYP2C19的H3K9ac和H3 K27ac修饰水平在正常组织中就显著低于CYP2C8和CYP2C9，在肿瘤组织中的下调也并不明显。肝脏组织与肿瘤组织之间这一组蛋白修饰的差异与之前数据分析得到的肝脏与其他组织之间的差异相一致。
　　综上所述，本文初步揭示了DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰是CYP2C亚家族组织特异性表达的可能机制。CYP2C亚家族在HCC中的异常表达，也受到这些表观遗传机制的调控，然而具体通路可能有所区别，有待进一步研究。研究这些机制将有助于我们了解表观遗传调控在细胞分化和肿瘤发生中的作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词

1 绪论

1．1 表观遗传学与基因的组织特异性表达

1．2 表观遗传学对CYP450转录表达的调控机制

1．3 CYP2C亚家族

1．4 本文研究内容

2．DNA甲基化和组蛋自修饰与CYP2C亚家族肝脏特异性表达的相关性

2．1 实验仪器与材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 本章小结

3．肝脏原代细胞中CYP2C亚家族表达水平与表观遗传学调控的关系

3．1 实验仪器与材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 本章小结

4．肝细胞性肝癌中CYP2C亚家族表达水平与DNA甲基化和组蛋白乙酰化的相关性

4．1 实验仪器与材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

5．总结与展望

综述 表观遗传学在肝细胞性肝癌诊断治疗中的研究进展

参考文献

附录

作者简介