携带miRNA的间充质干细胞来源外泌体抗肝癌研究

摘要

研究目的：
　　原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人类常见的恶性肿瘤之一，WHO发表的《全球癌症報告2014》指出我国肝癌死亡占全球肝癌死亡人数的51％。目前肝癌的最佳治疗手段仍以手术为主，但是由于早期发现与诊断的局限性，仅有15％符合手术指征。另外，肝癌化疗敏感性差、侵袭性强，导致其复发率高，5年病死率更是超过90％，因此明确肝癌治疗新靶点，探索抗肿瘤或化疗增敏的新策略意义重大。近年来miRNA与肿瘤的关系日益受到关注，研究显示其可对细胞增殖、分化、凋亡、癌变、激素分泌等诸多生物过程进行调节，有望成为肿瘤治疗的新靶点。本研究通过对肝癌临床样本与肝癌细胞系的分析，筛选出了一系列与肝癌增殖、转移相关的miRNA，并尝试用于肝癌的治疗或化疗增敏的研究。除此之外，要实现miRNA的临床应用，安全高效的体内运载体系开发亦是重要因素。而外泌体(exosome)作为一类天然脂质纳米微粒，是体内负责核酸及蛋白胞间转运的主要介质，其在药物运载方面较之传统病毒载体具有诸多潜在优势。在本研究中，我们首先通过分析肝癌临床样本中失调的miRNA或体外肝癌细胞系抗肿瘤治疗中差异表达的miRNA，筛选出具有抗肿瘤作用或化疗增敏效应的miRNA。随后通过转染miRNA到脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived Mesenchymal Stem Cell，AMSC)，并利用其制备大量携带这些具有治疗性的miRNA的exosome输注到荷瘤小鼠的肿瘤部位，实现化疗增敏效应。
　　第一部分 具有抗肝癌或化疗增敏作用的miRNA筛选以及机制研究
　　本文主要是通过两方面进行具有抗肝癌价值miRNA的筛选。首先是通过分析从临床来源的肝癌组织和与其匹配的癌旁组织样本中差异表达的miRNA，获得与肝癌发生发展相关的miRNA，以及其可能在肝癌化疗增敏中的作用和机制。其次是通过分析一些具有抗肝癌疗效药物的作用机制，找出其中与抗肝癌密切相关的miRNA，进而研究其在抗肝癌增殖以及化疗增敏方面的作用。实验结果提示在通过临床标本的分析获得的差异表达miRNA中，miR-122通过靶向抑制ADAM10、CCNG1和IGF1R的表达而实现对肝癌细胞的增殖抑制和周期阻滞，促进肝癌细胞凋亡，并可以提高肝癌一线靶向药物Sorafenib和5-FU的抗肿瘤效果。miR-199*除了可通过靶向抑制mTOR和c-Met的表达而实现抗肿瘤效果外，我们还发现其可以间接抑制Yap1的表达而对DNA损伤类药物的肝癌化疗有增敏作用。而在抗肿瘤药物的机制研究中筛选得到的miRNA中，发现miR-34a在槲皮素抗肝癌的作用中发挥重要作用，其可以通过靶向抑制SIRT1进而影响p53的乙酰化而使得p53更加稳定并促进凋亡。在抗肿瘤药物安奈菲特的衍生物MEAN的抗肿瘤机制中，我们则发现上调表达的miR-141可靶向抑制SPAG9，从而通过JNK通路发挥抗肿瘤与抗转移作用。最后我们还对四种miRNA在体外细胞系Huh7中进行了5-FU化疗增敏评估，显示四种miRNA都有不错的化疗增敏效果，其中miR-199*化疗增敏最明显，其次是miR-122。
　　第二部分 携带治疗性miRNA的脂肪间充质干细胞(AMSC)来源的exosome在肝癌治疗中的应用
　　我们首先从成人脂肪组织中分离培养得到AMSCs，并转染治疗性miRNAs(miRNA-122或miR-199*)，培养48h后，从其培养上清中分离得到具有典型表型特征（CD9+、CD63+和CD81+）的exosome(miRNA-Exo)。qPCR分析显示该exosome中富含上述miRNAs。采用miRNA-Exo单独处理肝癌细胞株或辅以化疗药物，发现miRNA-Exo处理组肝癌细胞的增殖抑制和细胞凋亡均显著增加，并且对化疗药物或靶向药物的敏感性更高。同时肝癌细胞株中miRNA-122或miR-199*的表达水平显著升高，而与之对应的miRNAs靶基因，如ADAM10、CCNG1、IGF1R、c-Met和Yap1等的表达水平则明显降低。显示携带特定治疗性miRNAs的exosome可实现miRNAs向靶细胞的有效传递，进而发挥抗肝癌和化疗增敏作用。我们进一步在肝癌荷瘤小鼠模型中分析了以exosome作为治疗性miRNA运载体的可行性。我们在肝癌异位荷瘤小鼠模型中，通过瘤内原位注射的方式进行miRNA-Exo的输注，并配合低剂量Sorafenib或5-FU的腹腔注射。药物治疗4周后，miRNA-Exo输注组的肿瘤体积、肿瘤重量均明显小于对照组;并且肿瘤组织中miRNA靶基因的表达亦显著低于对照组。显示AMSC来源的exosome可以作为治疗性miRNA的理想运载体，有效发挥miRNAs的抗肝癌和化疗增敏作用。
　　研究结论：
　　本研究进一步补充了miRNA在肝癌增殖、转移中的作用和调控机制。并证实用脂肪间充质干细胞来源的exosome可作为miRNA的有效运载体，实现特定miRNA向肝癌细胞的传递，通过调控肿瘤相关靶基因的表达进而发挥miRNA的抗肝癌或化疗增敏作用。我们的研究为miRNA的体内输注提供了新方法，为肝癌治疗及其化疗增敏提供了新思路和新手段。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩写注释表

研究背景

第一部分 具有抗肝癌疗效的miRNA筛选

研究背景

材料

1 细胞

2 主要仪器设备

3 主要试剂及配制方法

4 常用试剂的配置

方法

1、细胞培养

2、细胞增殖实验

3、细胞周期分析

4、miRNA芯片筛选差异表达的miRNA

5、miRNA转染实验

6、流式细胞仪检测细胞凋亡

7、细胞内总RNA提取

8、细胞总miRNA提取

9、RNA逆转录

10、荧光定量PCR

11、miRNA逆转录

12、miRNA探针法荧光定量PCR

13、BCA法蛋白定量

14、Western Blot检测

15、统计学分析

结果

一、miR-34a在肝癌治疗中的作用及机制研究

二、miR-141在抗肝癌转移中的作用及机制研究

三、miR-122的抗肝癌作用以及在肝癌化疗增敏中的作用及机制研究

四、miR-199*在肝癌化疗增敏中的作用及机制研究

五、4种miRNA的体外5-Fu增敏研究

讨论

第二部分 携带治疗性miRNA的脂肪间充质干细胞(AMSC)来源的exosome在肝癌治疗中的应用

1 细胞

2 主要仪器设备

3 主要试剂及配制方法

4 常用试剂的配置

方法

1、细胞培养

2、细胞增殖实验

3、细胞周期分析

4、miRNA芯片筛选差异表达的miRNA

5、miRNA转染实验

6、流式细胞仪检测细胞凋亡

7、细胞内总RNA提取

8、细胞总miRNA提取

9、RNA逆转录

10、荧光定量PCR

11、miRNA逆转录

12、miRNA探针法荧光定量PCR

13、BCA法蛋白定量

14、Western Blot检测

15、荷瘤模型构建

16、小动物活体成像

17、携带特殊miRNA的Exosome分离提取

18、Exosome的鉴定

19、AMSC的分离方法

20、统计学分析

结果

一、携带miR-122的exosome在荷瘤小鼠体内对5-Fu的肝癌化疗增敏研究

二、携带miR-199*的exosome在荷瘤小鼠体内对5-FU的肝癌化疗增敏研究

讨论

今后实验计划及展望

参考文献

综述 外泌体(exosome)特性、生理作用及其作为药物载体的研究进展

作者简历及在在学期间所取得的科研成果