PI3K/Akt通路在CO对内毒素攻击大鼠肺泡巨噬细胞线粒体MFN1和FIS1表达中的作用

摘要

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是临床急危重症，病因复杂，病情发展迅速，具有较高死亡率。ARDS的机制涉及炎症反应、氧化应激、水通道蛋白的形成和细胞凋亡等多方面；其中氧化应激和炎症反应对ARDS发展及转归起主要作用。线粒体是活性氧产生的主要场所，与炎症反应密切相关，线粒体融合和分裂运动是维持线粒体功能的重要调节因素，氧化应激损伤可导致线粒体融合减少、分裂增多[1-2]。
　　研究发现，一氧化碳（Carbon Monoxide，CO）是血红素氧化酶-1(heme o xygenase-1，HO-1）降解血红素的产物，具有抗炎抗氧化应激的作用，HO-1/C O可对ARDS有保护作用[3]。本课题组前期研究是从线粒体动力学角度阐释C O对ARDS的保护机制，即CO减少内毒素所致肺泡巨噬细胞的凋亡，减轻氧化应激和炎症反应，并促进肺泡巨噬细胞线粒体融合蛋白-1（MFN1）的表达，降低分裂蛋白FIS1的表达[4-5]。1-磷酯酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(P I3K/Akt）信号通路广泛存在于各种细胞中，调控细胞生长与存活、增殖、凋亡、糖类代谢、基因转录、细胞迁移运动和细胞周期等多种细胞活动[6-7]。研究表明， PI3K/Akt通路可以提高HO-1的表达对脓毒症所致ARDS具有保护作用[8-10]。本研究拟通过建立大鼠内毒素攻击肺泡巨噬细胞模型，给予 CO释放剂 CORM-2和PI3K/Akt通路阻断剂LY294002，探讨内毒素攻击大鼠肺泡巨噬细胞时，PI3 K/Akt信号通路在CO对MFN1和FIS1表达中的作用。
　　目的：评价 PI3K/Akt通路在 CO对内毒素攻击大鼠肺泡巨噬细胞线粒体MFN1和FIS1表达中的作用。
　　方法：传代培养12~20周龄大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383，以密度4×104个/ml接种于96孔板，培养24 h后，采用随机数字法分为10组（n=10）：对照组（C组）、内毒素组（L组）、内毒素+一氧化碳释放剂组（L+O组）、内毒素+一氧化碳释放剂+阻断剂组（L+O+Y组）、内毒素+DMSO组(L+D组)、内毒素+iCORM-2组（L+iC组）、内毒素+阻断剂组（L+Y组）、一氧化碳释放剂组（O组）、阻断剂组（Y组)、一氧化碳释放剂+阻断剂组（O+Y组)。L组、L+O组、L+O+Y组、L+D组、L+iC组、L+Y组均给予10μg/ml LPS处理大鼠肺泡巨噬细胞NR8383，制备内毒素攻击模型；L+O组于LPS处理前1 h给予CORM-2100μmol；L+D组、L+iC组于LPS处理前1 h分别给予DMSO和iCORM-2100μmol。
　　L+O+Y组分别于LPS处理前1.5、1.0 h给予抑制剂LY29400220μg、CORM-2100μmol；L+Y组于LPS处理前1.5 h给予LY29400220μg。O组给予CORM-2100μmol，Y组给予抑制剂 LY29400220μg， O+Y组前后相差0.5h给予抑制剂LY29400220μg、CORM-2100μmol。C组正常培养，加入等量PBS溶液作空白对照组。每组细胞处理完毕后继续孵育24 h再收集各组细胞样本。采用ELISA法测定细胞上清液 TNF-α和 IL-10的含量，按照相应的试剂盒上的指示测定细胞中ROS、MDA含量和SOD、ATP酶活力；采用RT-PCR和Western blot法测定细胞中MFN1、FIS1、HO-1、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)的表达。
　　结果：与L组相比，C组和L+O组IL-10含量、ATP酶活力和SOD活性增高，MDA、ROS和TNF-α含量减少；L+Y组SOD活性下降，IL-10含量减少， MDA、ROS和TNF-α含量增加（P<0.05）。与L+O+Y组相比，L+O组和O+Y组IL-10含量增加，SOD活性增高，MDA、ROS和TNF-α含量减少；L+Y组MDA、ROS和TNF-α含量增高，SOD活性下降，ATP酶活力和IL-10下降（P<0.05）。与L+O组相比，L+iC组IL-10含量减少，SOD活性下降，TNF-α和MDA含量增高；O组IL-10含量增多，SOD活性增高，MDA含量减少（P<0.05）。
　　与L组相比，C组HO-1表达及mRNA水平下降，MFN1表达及mRNA水平升高，FIS1表达及mRNA水平下降；L+O组HO-1和MFN1表达及mRNA升高，FIS1表达及mRNA下降，Akt、p-Akt的表达增多；与L+O+Y组相比， L+O组HO-1和MFN1表达及mRNA水平上升，Akt、p-Akt的表达增多，FIS1表达及mRNA水平下降；L+Y组HO-1和MFN1表达及mRNA水平下降，FIS1表达及mRNA水平下降，Akt表达减少（P<0.05）。与L+O组相比，L+iC组HO-1和MFN1表达及mRNA水平下降，FIS1表达及mRNA水平升高，Akt表达减少（P<0.05）；与L+Y组相比，L+D组HO-1和MFN1表达及mRNA水平上升，FIS1表达及mRNA水平下降，Akt表达增多（P<0.05）。
　　结论：CO促进大鼠肺泡巨噬细胞内毒素损伤时线粒体MFN1的表达，抑制FIS1的表达，而PI3K/Akt信号通路是其机制之一。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象和方法

1.1实验细胞

1.2主要实验药品与试剂

1.3主要实验仪器

1.4液体配制

1.5 实验方法

1.6检测指标

1.7统计学处理

2结果

2.1 各组IL-10、TNF-α含量测定结果

2.2各组细胞MDA含量和SOD活性测定

2.3各组细胞ATP酶活力、ROS的含量

2.4各组细胞HO-1表达及mRNA水平

2.5各组细胞MFN1表达及mRNA水平

2.6各组细胞FIS1表达及mRNA水平

2.7各组细胞总Akt、磷酸化Akt(p-Akt)的表达水平

3讨论

3.1 模型细胞的选择

3.2 大鼠内毒素攻击肺泡巨噬细胞模型的建立

3.3 实验分组的设置

3.4一氧化碳释放剂的选择

3.5 PI3K信号通路阻断剂的选择

3.6 HO-1/CO与内毒素大鼠攻击肺泡巨噬细胞

3.7 PI3K/Akt信号通路在CO对大鼠内毒素攻击肺泡巨噬细胞MFN1和FIS1的表达中的作用

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:PI3K/Akt信号通路对心肌损伤研究进展

致谢

个人简历