MicroRNA作为肺癌早期诊断及预后预测标志物的研究

摘要

肺癌是目前发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。在中国，肺癌的发生率和死亡率均呈持续上升趋势。由于目前缺乏有效的早期检测手段，大部分肺癌患者在发现时已处于中晚期。尽管近年来，肺癌在治疗手段上有了明显进展，但晚期肺癌患者的预后仍然较差。因次，我们仍需寻找一种方便、安全、有效的肺癌早期检测及预后预测手段。
　　MicroRNAs(简称miRNAs)是一类高度保守非编码单链RNA，通过与mRNA的3’或5’非编码区结合，抑制其翻译或促进其降解，在转录后水平发挥基因调控作用。大量研究表明，miRNA可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生，发展。而且，miRNA还可稳定的存在于循环中，这一特性使其有可能成为一种方便，无创，有效的肿瘤标志物。
　　本研究前两部分，首先分别针对肺腺癌和肺鳞癌这两种肺癌最为常见的病理类型，开展对其有早期诊断意义的血浆miRNA筛选及验证工作。在论文的第一部分，我们首先利用Taqman低密度芯片（TaqMan low density array，TLDA)，通过对比5例早期肺腺癌患者血浆和5例健康人血浆miRNA表达谱，筛选出表达差异最为显著的20种miRNA。而后经过三个独立队列的验证，筛选出3个稳定表达的血楽miRNA：miR-425-3p，miR-628-3p和miR-532。而后，我们建立了针对肺腺癌miRNA组合风险评分模型，通过ROC曲线分析，此模型敏感性达91.5%，特异性达97.8%。另外，我们检测了3个肺腺癌miRNA在肺鳞癌，小细胞肺癌，大细胞肺癌中的表达情况，结果显示3种miRNA在肺腺癌和其他肺癌病理亚型中的表达有显著差异。另外，miR-425-3p及miR-628-3p在胃癌，甲状腺癌，结肠癌和胰腺癌中的表达模式也与肺腺癌中不完全相同，表明此3种miRNA具有一定的病理类型及器官特异性。miR-628-3p和miR-425-3p在晚期腺癌中的表达显著上调，而miR-532在晚期腺癌中的表达则显著下调，表明这3种miRNA可能与疾病的进展相关。
　　论文的第二部分，我们首先利用TLDA芯片，对比5例I期肺鳞癌患者血浆和5例健康人血楽miRNA表达谱，筛选出表达差异最为显著的20种miRNA。后经三个独立队列的验证，筛选出2个稳定表达的miRNA:mir-324-3p和miR-1285。而后，我们建立了2种miRNA组合的肺鳞癌风险评分模型，通过ROC曲线分析，此模型敏感性为85.4%，特异性为81.8%。通过对比血浆miR-324-3p 和miR-1285在肺鳞癌与肺腺癌，小细胞肺癌，大细胞肺癌和肺良性病变中的表达情况，发现2种miRNA在肺鳞癌和其他肺癌病理亚型或肺良性病变中的表达有显著差异。另外，我们还检测了2种miRNA在胰腺癌，食管鳞癌，胃癌，甲状腺癌及乳腺癌患者血浆中的表达情况。结果显示，miR-324-3p和miR-1285在上述癌症类型中的表达模式与肺鳞癌中不同。这表明此2种miRNA是特异性的肺鳞癌标志物。另外，miR-324-3p在晚期肺鳞癌患者血浆中的出现显著上调，而miR-1285在晚期肺鳞癌中的表达则与早期无明显差异，表明miR-324-3p可能与肺鳞癌的进展有关。
　　论文第三部分，针对低剂量螺旋CT(LDCT)在肺癌筛查中假阳性率高的问题，我们开展了LDCT联合血浆miRNA标志物对肺癌高危人群筛查双盲前瞻性研究。在纳入346例肺癌高危人群中，单独使用LDCT发现可疑结节31例，其中6例经手术证实为I期肺腺癌，其余25例皆为良性结节。虽然LDCT敏感性达100%，但假阳性率高达80.6%。当以血浆miRNA标志物及LDCT双阳性作为诊断标准时，其假阳性率可显著降低，仅为42.8%。因此，研究前两部分建立的血浆miRNA模型可作为LDCT的有效补充，降低肺癌高危人群筛查的假阳性率。
　　论文的第四部分，我们使用生物信息学的方法，利用TCGA肺鳞癌队列，开展了对肺鳞癌有预后预测意义miRNA筛选验证研究。我们首先利用45对癌和癌旁配对组织的二代测序数据，筛选出143个显著差异表达miRNA。而后将患者按照TNM分期，分为不同亚组，使用单因素COX回归分析miRNA与患者总生存期（overall survival，OS)的关系。共12个miRNA在至少两个亚组中均与患者的OS相关。而后将447例患者随机分为训练队列和验证队列，使用监督主成分分析，筛选出7个miRNA(hsa-miR-139,hsa-miR-326,hsa-miR-101-2,hsa-miR-182,hsa-miR-183,hsa-miR-190,hsa-miR-944)的最佳组合，并建立预后危险评分模型。使用该模型将患者分为高危组和低危组，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，低危组患者的生存时间显著长于高危组患。而且，该模型还可有效预测早期肺鳞癌患者的预后。多因素COX回归分析显示，此miRNA组合是肺鳞癌患者预后的独立危险因素。
　　综上所述，本研究筛选验证了针对可用于肺腺癌和肺鳞癌早期诊断的特异性血浆miRNA标志物组合。两种miRNA模型可作为LDCT重要补充，显著降低肺癌高危人群筛查的假阳性率。同时，建立用于肺鳞癌预后预测的miRNA标志物组合，在今后经多中心大样本临床验证后，将有望成为肺鳞癌预后判断的新型标志物。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、对肺腺癌有早期诊断意义血浆miRNA的筛选及验证

1.1对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、对肺鳞癌有早期诊断意义血浆miRNA的筛选及验证

2. 1 对象和方法

2. 2 结果

2. 3 讨论

2. 4 小结

三、LDCT联合血浆miRNA组合对肺癌高危人群筛查研究

3. 1 对象和方法

3. 2 结果

3. 3 讨论

3. 4 小结

四、MiRNA作为肺鳞癌预后预测标志物的研究

4. 1 对象和方法

4. 2结果

4.3 讨论

4 .4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述：MiRNA在肺癌中的研究进展

致谢

个人简历