小麦-非洲黑麦渐渗系的鉴定与抗条锈基因的分子作图

摘要

非洲黑麦（Secale africanum Stapf，Ra基因组）是黑麦属的重要多年生物种，但现在已处于濒临灭绝的边缘。非洲黑麦表现出矮杆和对多种病害具有抗性的优异性状，因此对这一珍贵资源中优异基因的研究与开发具有重要意义。小麦条锈病是我国小麦生产中最重要的病害之一，发掘小麦抗条锈病新抗源、明确抗条锈病基因、进行可持续性抗病遗传育种研究，对我国小麦生产具有重要的意义。本文从非洲黑麦特异标记的开发，小麦-非洲黑麦渐渗系的创制与鉴定以及渐渗系中抗条锈病基因进行了研究，获得结果如下：
　　 ⑴非洲黑麦新型重复序列的分离、染色体定位与应用。从非洲黑麦中分离得到三个黑麦基因组特异重复序列pSaP131165、pSaP13662和pSaO5411。序列比对发现，pSaP131165和pSaO5411分别为Revovler和Tyl-copia型反转录转座子序列，pSaP13662为反转录转座子的部分序列。以这3个序列做为探针，用荧光原位杂交分析了它们在非洲黑麦染色体上的分布情况，结果发现pSaP131165和pSaO5411弥散状分布在除端部外的所有黑麦染色体臂上，而在小麦染色体上没有分布。pSaP13662在黑麦染色体上没有原位杂交信号。将这3个重复序列转化为SCAR标记（P13LF/R、P13SF/R和O5F/R），通过对黑麦属物种、部分小麦族近缘物种及小麦.非洲黑麦的渐渗系材料的PCR扩增检验发现，这3个新的SCAR标记能很好的用于黑麦染色质的特异性检测。
　　 ⑵小麦-非洲黑麦双二倍体的分子细胞遗传学鉴定。利用顺序染色体C带和基因组原位杂交技术对安岳排灯麦-非洲黑麦双二倍体（AF）和波斯小麦-非洲黑麦双二倍体（BF）进行分析，建立了非洲黑麦的标准C带图，发现非洲黑麦的染色体1Ra、2Ra、3Ra、5Ra和6Ra与栽培黑麦的1R、2R、3R、5R和6R相似，染色体4Ra和7Ra在长度和异染色质上明显少于栽培黑麦的4R和7R染色体。在对32株小麦-非洲黑麦的双二倍体（BF）的细胞观察时发现，12株的细胞中存在非洲黑麦染色体断裂，9株中存在非洲黑麦和小麦染色体的小片段易位；在16株AF后代中发现了3株有非罗伯逊易位。结果说明在双二倍体中存在大量的小麦-非洲黑麦染色体重组，这对进一步研究非洲黑麦-小麦远缘杂交具有重要意义。
　　 ⑶新型小麦-非洲黑麦1RaS/1BL和小片段渐渗系的鉴定。在BF与MY11小麦杂交F6后代材料中，我们利用SCAR标记（P13LF/R、P13SF/R和O5F/R）检测出36株材料含有黑麦染色质，并通过抗条锈观察筛选出了19株抗条锈病材料。利用非洲黑麦基因组为探针，对这19株材料进行原位杂交，发现11株有杂交信号。结合染色体C带分析发现：材料L1只携带一条1RaS/1BL易位染色体；L3携带一条黑麦染色体小片段插入易位到小麦染色体上；L9-15携带了一对1RaS/1BL易位染色体；L16中发现非洲黑麦染色体3Ra与小麦染色体3BS的端部易位；L17为1Ra代换系。其他抗条锈病材料利用GISH没有检测到杂交信号，这些不同类型的小麦-非洲黑麦异染色体系材料可以用于转移非洲黑麦抗条锈病基因。
　　 ⑷小麦-非洲黑麦衍生系材料L2中的抗条锈病基因分子作图。通过标记和近等基因系的鉴定，L2中的抗条锈病基因为Yr17基因。对Yrl7基因进行了分子作图，开发出了两个与Yrl7基因紧密连锁的SCAR标记SC-385、SC-372和一个基于EST的标记Xbcd348，其中标记SC-385与Yrl7基因的距离为3.4cM，是至今最近的Yrl7基因连锁标记。对小麦中Yr17基因区段与水稻基因组进行了比较分析，建立了该区段与水稻的共线性关系，确定了Yr17基因区段在水稻中的共线性区段，为进一步利用BAC克隆开发新的标记来图位克隆Yr17基因奠定了基础。
　　 ⑸非洲黑麦丙酮酸脱氢酶α亚基基因（PDHA1）序列分析。研究小麦族PDHA1基因第2内含子序列发现，非洲黑麦和森林黑麦基因组中存在特异的MITE插入，并根据此序列开发出非洲黑麦和森林黑麦染色体特异的分子标记。利用PDHA1基因对小麦族进行了系统学分析，发现可以利用内含子多态性来研究种间的系统进化关系。对PDHA1基因进行染色体定位，发现PDHA1基因位于小麦第二同源群、偏凸山羊草2N和簇毛麦2V染色体上。根据PDHA1基因序列，成功构建了PDHA1基因的原核表达载体pET28a-PDHA1。原核表达结果表明PDHA1基因能够体外高效表达，为非洲黑麦中该基因的分离与应用提供了参考。
　　 综上所述，本研究围绕非洲黑麦基因资源向栽培小麦导入的研究，开发了一系列染色体组、染色体片段特异性分子标记，同时对育成小麦-非洲黑麦异染色体系材料进行了分子细胞学鉴定，并对1份渐渗系中的抗条锈病基因进行了分子标记分析，为进一步开展小麦染色体工程育种中利用非洲黑麦基因资源打下了基础。