血红素加氧酶-1介导Tr1细胞抑制哮喘气道炎症的研究

摘要

背景： 血红素加氧酶（heme oxygenase，HO）是血红素代谢途径中的限速酶，将血红素降解为等量的胆绿素、CO和亚铁离子，胆绿素经胆绿素还原酶生成胆红素。HO有三种同工酶，即诱导型HO-1，组成型HO-2及近年来发现的异构体HO-3。其中HO-1又为应激蛋白，具有显著的抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡和抗平滑肌增生作用。HO-1及其降解产物胆绿素、胆红素和CO均具有抗炎和抗氧化应激效应，在抑制支气管哮喘气道炎症的发生和发展中起着重要的作用。 调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）有多种亚群，按其来源可分为天然发生的T调节细胞（naturally occurring regulatory T cells，nTreg）和诱导性T调节细胞（inducing regulatory T cells，iTreg）。nTreg主要是胸腺来源的CD4+CD25+Treg，约占外周血CD4+T细胞的5％~10％，是Treg细胞的主要组成部分。iTreg可以由CD4+T细胞在特定的条件如细胞因子作用下诱导产生，并且选择性地表达调节活性，Tr1是iTreg中最为重要的细胞亚群，通常受外周高浓度抗原刺激后从na?ve T细胞分化而来，免疫抑制性细胞因子IL-10是Tr1产生的动力，而Tr1又通过分泌IL-10调节免疫反应，抑制体内外na?ve T细胞和记忆性T细胞反应。到目前为止，Treg的具体作用机制尚未完全阐明。 关于哮喘的发病机制目前尚未明确，但气道慢性炎症被认为是哮喘的本质。鉴于HO-1和Tr1在哮喘防治中所起的保护作用，推测HO-1通过诱导Tr1细胞分化，增加IL-10分泌，调节免疫反应进而抑制哮喘气道炎症。 目的： 利用体外细胞培养和哮喘动物模型，上调HO-1表达，分析HO-1与Tr1/IL-10和哮喘间的关系，探讨HO-1介导Tr1细胞、促进IL-10分泌以拮抗哮喘气道炎症。 方法： 体外实验：MACS 磁珠分选naive CD4+T细胞，B7H1/IL-10诱导培养，并经血红素（Hemin）和锡-原卟啉（Sn-protoporphyrin，SnPP）共培养干预。分别在3，7，10和14天收集细胞进行三色荧光标记抗体染色：anti-CD4-APC、anti-IL-10R-PE、Biotinylated anti-IFN-γR和anti-Biotin-FITC，流式细胞计数测定三标记均阳性的细胞即Tr1的比例。 体内实验：用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏、激发C57B6小鼠建立哮喘模型，并在致敏、激发阶段分别经Hemin和SnPP干预。肺泡灌洗液细胞计数和肺脏病理组织学检测评价哮喘气道炎症；Real-Time PCR和Western blot方法分别测定脾脏细胞内HO-1、IL-10 mRNA表达和HO-1蛋白量；ELISA方法测定动物血清OVA-特异性IgE（OVA-sIgE）和IL-10水平；流式细胞计数测定脾脏细胞和外周血单个核细胞中CD4+IL-10R+IFN-γR+Tr1，CD4+ IL-10R+IFN-γR+IL-10+Tr1的比例；流式细胞仪分选Tr1细胞并测定其抑制效应T细胞增殖功能。 结果： 体外实验：Hemin诱导HO-1高表达后不能直接诱导naive CD4+T细胞分化为Tr1。 体内实验：OVA致敏、激发的哮喘小鼠模型，经Hemin干预后，Tr1比例增加，脾脏细胞HO-1和IL-10 mRNA 表达上调，HO-1蛋白水平明显增加，血清IL-10水平增高，哮喘气道炎症减轻。 结论： 在体外HO-1不能直接诱导Tr1 细胞分化；在哮喘动物模型中HO-1通过促进IL-10的分泌间接诱导Tr1细胞，进一步增加IL-10的分泌，抑制效应T细胞增殖从而抑制哮喘气道炎症。