泛素-蛋白酶体途径参与人视网膜色素上皮细胞氧化应激过程的研究

摘要

目的：泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasomepathway，UPP)是一种高效的蛋白分解途径，在许多细胞代谢中起调节作用；UPP还有非蛋白水解作用。组织、细胞的衰老和应激会引起该途径的变化。现已发现许多老年性疾病的发生与UPP功能下降相关。年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，ARMD，AMD)是发达国家老年人群主要的致盲疾病之一。目前AMD发病的机理尚不明了。视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium，RPE)在AMD发病中的作用已引起广大研究人员的重视。基于对UPP在老年性疾病中作用的认识，以及探明AMD发病机理的重要性，本研究在证实UPP可能参与快速衰老小鼠(senescence-acceleratedmouse，SAM)P8模型视网膜老化过程的基础上，采用过氧化氢诱导的氧化应激模型，检测UPP在人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)氧化应激过程中的变化，探索抑制氧化应激的靶点，为临床视网膜抗氧化，防止AMD寻找理想的干预方式。 方法：本研究首先用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)方法(包括DAB底物显色方法和免疫荧光方法)检测SAMP8和R1小鼠模型视网膜中泛素化蛋白和蛋白酶体的表达。细胞实验方面，先用不同浓度过氧化氢作用ARPE-19二十四小时后，用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测细胞活力。然后选择不同浓度过氧化氢作用细胞4小时后收集样本，RT-PCR和westernblot方法检测细胞中泛素化蛋白和蛋白酶体的转录和表达水平，免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)方法检测泛素化蛋白和蛋白酶体在细胞中的分布变化。在蛋白酶体抑制剂MG-132对ARPE-19氧化应激中氧化蛋白表达影响的研究中，先用MG-132预处理细胞90分钟，再给予细胞过氧化氢处理4小时，用活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)检测试剂盒检测ROS的变化，westernblot方法检测细胞中羰基化蛋白的表达水平，ICC方法检测羰基化蛋白在细胞中的分布。最后将构建好的真核表达载体pcDNA3-PSMB5质粒转入ARPE-19中，用RT-PCR和westernblot检测细胞内PSMB5基因的转录和表达；再在氧化应激条件下，用蛋白酶体活性检测试剂检测过表达PSMB5的ARPE-19中细胞糜蛋白酶活性变化，用MTT法检测细胞活性变化。 结果：与11月龄的SAMR1小鼠相比，11月龄的SAMP8小鼠视网膜中检测到泛素化蛋白的增加，PSMB5表达下降。50-300μM过氧化氢加入ARPE-19培养4小时后细胞活力保持在75％以上。分别用不同浓度过氧化氢50-300μM作用ARPE-19四个小时后，泛素基因UbA52和UbB转录增加，细胞内泛素化蛋白及蛋白酶体的表达增加，泛素化蛋白和蛋白酶体的分布多集中在核内及核膜周围。在50μM过氧化氢作用一小时时RPE细胞内蛋白酶体糜蛋白酶活性增加，而200μM和300μM过氧化氢作用后活性下降。用MG-132预处理后再给予细胞过氧化氢刺激4小时收集细胞，与未作MG-132预处理相比，细胞内ROS明显增加，细胞中羰基化蛋白的表达水平明显增加，细胞中羰基化蛋白聚集在胞浆和核周。将pcDNA3-PSMB5质粒转入ARPE-19中，与pcDNA3转染细胞相比，PSMB5基因转录和表达水平明显增加。PSMB5过表达细胞在氧化应激后，细胞内蛋白酶体糜蛋白酶活性下降较空载体转染细胞低，而且细胞活力明显高于空载体转染的对照组。 结论：UPP存在于SAM鼠视网膜，氧化应激会导致ARPE-19细胞内UPP的激活，高浓度过氧化氢抑制蛋白酶体糜蛋白酶活性；抑制细胞内蛋白酶体活性，细胞内ROS和氧化蛋白量增加；过表达PSMB5对ARPE-19有保护作用。因此，UPP参与RPE细胞氧化应激及衰老的过程，有可能在AMD发病中起到重要的作用。

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论文说明：图题索引、缩略词表

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绪论

第一章泛素化蛋白及蛋白酶体在高龄SAM鼠视网膜中的表达变化

1.1前言

1.2材料与方法

1.3结果

1.4讨论

第二章过氧化氢诱导ARPE-19中泛素化途径的激活

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

第三章过氧化氢对ARPE-19中蛋白酶体的活性和表达影响

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

第四章蛋白酶体抑制剂MG-132对ARPE-19中氧化蛋白清除的影响

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果

4.4讨论

第五章蛋白酶体β5亚基过表达对ARPE-19的保护作用研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.3结果

5.4讨论

结论

参考文献

附录

致谢

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