转Bt基因水稻对土壤微生物的影响及稻田二化螟遗传多样性研究方法的建立

摘要

水稻等主粮转基因育种具有对目标性状定向变异、育种周期短等诸多优点，但食品安全与生态安全等方面的基础研究工作有待深入、广泛开展，这方面的研究将有助于转基因作物稳妥、科学、安全地推广应用。
　　本研究拟采用传统培养方法和高通量测序技术研究稻田土壤微生物尤其是土壤重要功能微生物对转Bt基因水稻的响应。基于Sanger测序技术和PCR-DGGE技术，建立了两种转基因稻田昆虫遗传多样性的研究方法。
　　基于传统培养方法，对种植转Bt基因水稻及其亲本稻的稻田土壤微生物的丰度进行连续两年的追踪，实验结果表明，非转基因水稻种植稻田细菌丰度变化范围在3.28-17.7×106 CFU/g干土，真菌丰度变化范围在2.56-8.09×104 CFU/g干土，放线菌丰度变化范围在0.36-4.52×106 CFU/g干土；转基因组细菌丰度变化范围在3.01-15.2×106 CFU/g干土，真菌丰度变化范围在2.13-12.4×104 CFU/g干土，放线菌丰度变化范围在0.31-3.9×106 CFU/g干土。转基因与非转基因组间的差异不具有统计学意义。
　　基于454焦磷酸测序技术，分别对细菌16S V1-V3区和真菌ITS ITS1-ITS4区进行了测序，两年共得到498378条细菌有效序列，765283条真菌有效序列。基于2012年测序结果比对分析确定95属细菌，确定182属真菌。非转基因稻田土壤细菌群落的Chao和Shannon指数分别为1965.33和6.67234，真菌的Chao和Shannon指数分别为1654.23和3.791402；转基因组土壤细菌Chao和Shannon指数分别为1798.35和5.95488，真菌的Chao和Shannon指数分别为1792.38和3.69263，两组间未发现明显差异。基于2013年测序结果，确定104属细菌，确定151属真菌，比较分析转基因组和非转基因组之间的Chao、Shannon等指数，两组间也未发现明显差异。
　　研究Anaeromyxobacter、Nitraspira、Dactylella等重要土壤功能细菌和真菌对转 Bt基因水稻的响应，分析发现，转基因组中Anaeromyxobacter、Nitraspira、Thiobacillus三个属在样品中所占的比例大于非转基因组，Dactylella、Taifanglania两个属在样品中所占的比例小于非转基因组，但这种差异不明显。
　　本研究工作采集了湖南、江西两地稻田各30只二化螟样本，并从中各随机选择了12个样本进行了研究，通过二化螟样本的COⅠ基因的测序结果分析发现，COⅠ基因的35~692 bp区段存在丰富的多态（在658个碱基中检测到173个多态位点），因此该区段非常适合开展二化螟种群遗传多样性的分析。结合COⅠ基因序列数据，本研究自行设计了可用于DGGE分析的引物，使用PCR-DGGE来研究二化螟的遗传多样性。DGGE指纹图谱与常规测序数据构建的系统发生树结果基本一致。
　　本工作获得的转基因稻田的可培养微生物和不可培养微生物数据，为下一步深入研究转Bt基因水稻的生态安全性提供了详实的基础资料。本工作建立的转基因稻田昆虫遗传多样性的两种研究方法，将为回答转Bt基因水稻对稻田昆虫的安全性这一科学问题提供方法学支持。

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第一章 绪论

1.1 转Bt基因水稻概述

1.2 转Bt基因水稻的生态安全性评价

1.3 线粒体基因在昆虫遗传多样性研究中的应用

第二章 转Bt基因水稻对土壤微生物的影响

2.1 材料

2.2方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 转Bt基因稻田昆虫遗传多样性研究方法的建立

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章 结束语

4.1 主要工作与创新点

4.2 后续研究工作

参考文献

附录Ⅰ

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文