羧甲基转移酶StnF3及碳甲基转移酶MarI的结构与功能研究

摘要

甲基转移酶是一类重要的修饰酶，主要以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）作为甲基供体，催化底物的碳、氮、氧或硫原子的甲基化反应。链黑菌素是由一株绒毛链霉菌产生的多官能团的生物碱类抗生素，具有多种生物活性，如广谱的抗菌活性、抗病毒活性，以及强烈的、广谱的抗肿瘤活性。前期的研究表明，链黑菌素的生物合成基因簇中含有8个编码甲基转移酶的基因，其中包括一个碳-甲基转移酶StnQ1,三个氧甲基转移酶（StnQ2-Q4）和四个亮氨酸羧甲基转移酶(StnF1-F4)。这四个羧甲基转移酶具有高度的一致性（61-68％）和相似性（72-77%），其中StnF2专一性地催化淡紫醌霉素的甲基化生成淡紫醌霉素甲酯，StnF3则催化10?-去甲基链黑菌素和10?-去甲氧基链黑菌素的甲基化生成相应的甲酯，而其他的羧甲基转移酶则不能催化相应的反应，表明尽管这四个羧甲基转移酶高度同源，但是具有较严格的底物专一性。为了阐明羧甲基转移酶的底物选择性机理，我们开展了它们的结构生物学研究，期望获得它们的晶体结构。
　　我们成功地获得了StnF3的单晶，通过Se-SAD的方法解析了StnF3的母体晶体结构，同时也获得了StnF3-SAM和StnF3-SAH复合物的晶体结构，明确了StnF3的SAM结合位点。通过分子动力学模拟，提出了StnF3结合SAM的活性口袋的开-关状态。在StnF3母体的结构中该口袋处于关闭（close）状态，而在溶液中，活性口袋周围的较为灵活的loop区域发生移动使活性口袋转为开（open）的状态，从而为结合SAM提供空间。此外，利用StnF3-SAM复合物结构与底物进行分子对接，提出了ARG-16和TYR-177与底物的结合有关，并利用点突变进行的证实，R16A和Y177F的活性相较于母体分别降低了约240倍和70倍。由此表明，该区域与底物的结合的确密切相关。通过多序列比对发现，与SAM和底物结合相关的loop区域正是StnF3与其他三个羧甲基转移酶差异最大之处，可以初步解释其他羧甲基转移酶不能替代StnF3的原因。
　　StnQ1及其同源蛋白MarI(Maremycin的生物合成途径)被证实不仅可以催化吲哚丙酮酸的?-碳甲基化反应，而且在较高浓度下可以直接催化色氨酸的?-碳甲基化。该反应是从未报道过的，表明StnQ1和MarI可能通过一个全新的机理催化色氨酸的甲基化反应。于是，我们开展了StnQ1和MarI的结构生物学研究。我们只获得了MarI的单晶，但是分辨率不足以解析它的结构。我们进一步获得了MarI与SAM的复合物的晶体，经X-ray衍射收集了分辨率为2.43?的复合物数据,明确了SAM的结合位点ASP-206和ASP-234。并且在HIS-261和HIS-314结合区存在一个较大的电子云，目前还无法确定是一个有机分子，或是一个金属离子。
　　这两个甲基转移酶晶体结构的解析，为揭示 StnF3的底物确定性机理以及 MarI催化色氨酸甲基化的酶学机理奠定了基础，但仍有后续工作需进一步深入开展。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 绪论

1.1甲基转移酶

1.1.1 概述

1.1.2 分类

1.1.3 天然产物甲基转移酶

1.1.4 亮氨酸羧甲基转移酶

1.2结构生物学

1.3本工作研究目的和意义

第二章 羧甲基转移酶StnF3的晶体结构及其催化机制研究

引言

2.1实验材料

2.1.1 常用试剂

2.1.2 溶液配制

2.1.3 实验仪器

2.1.4 菌种及质粒

2.2实验方法

2.2.1 蛋白质表达与纯化

2.2.2 蛋白质结晶与结构解析

2.2.3 计算生物学

2.3结果与分析

2.3.1 StnF3生物信息学分析

2.3.2 StnF3蛋白纯化

2.3.3 StnF3母体晶体数据收集

2.3.4 StnF3硒代晶体数据收集及处理

2.3.5 StnF3与SAM复合物结晶

2.3.6 StnF3、SAM（SAH）与底物的复合物结晶尝试

2.3.7 StnF3母体以及复合物的整体结构

2.3.8 StnF3结合SAM后发生构象变化

2.3.9 StnF3的SAM结合位点

2.3.10 StnF3的分子动力学模拟

2.3.11 StnF3-SAM复合物与底物12的分子对接

2.3.12 StnF3底物结合位点的突变验证

2.4讨论

2.5小结

第三章 碳甲基转移酶MarI结构研究

引言

3.1实验材料

3.1.1 常用试剂

3.1.2 溶液配置

3.1.3 实验仪器

3.1.4 菌种及质粒

3.2实验方法

3.2.1 蛋白表达

3.2.2 蛋白纯化

3.2.3 蛋白结晶与结构解析

3.3结果与分析

3.3.1 生物信息学分析

3.3.2 蛋白表达与纯化

3.3.3 MarI及其复合物的结晶、数据收集与处理

3.3.4 MarI-SAM复合物的整体结构

3.3.5 SAM结合位点

3.3.6 MarI底物结合的探究

3.4小结

总结及其展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文