匹罗卡品癫痫模型小鼠癫痫发生急性期脑电特性研究

摘要

癫痫是常见的神经系统疾病之一，它发作的直接原因是脑内神经元的高度同步化异常放电，因此脑电分析是诊断癫痫的重要手段之一。近年来，有研究表明脑电中的高频振荡（high-frequency oscillations，HFOs），即ripple（80-200 Hz）和fast ripple（250-500 Hz），和癫痫发作有着密切的联系：在局灶性癫痫病人中，HFOs常出现在慢波睡眠期和起始发作区，且切除难治性癫痫病人产生HFOs的组织会有较好的手术治疗效果。因此，关于HFOs的研究成为近年来的一大热点。但由于临床实验的局限性，目前对于癫痫的研究主要还是在动物模型上进行，匹罗卡品（pilocarpine，PILO）模型是一种最常用的慢性小鼠癫痫模型，PILO癫痫模型中关于HFOs的研究目前主要集中在慢性反复痫性自发发作期，几乎没有关于PILO急性期HFOs的研究，所以本研究中我们通过分析 PILO注射前后小鼠脑电功率谱、HFOs数目及平均持续时间的变化来探究其与大发作的关系。
　　目前，已经有临床试验尝试通过转移基因来治疗一些神经系统疾病，如阿尔茨海默症，而用来转移这些基因的载体主要是经过改造和修饰的病毒，常用的有腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒等。相较于其他病毒，慢病毒具有转移大的基因片段并将基因整合到宿主的基因组中实现长期而稳定的表达等方面的优势，这也使得慢病毒在神经系统疾病中的研究与应用受到关注。因此在本研究中，我们检测了以GFAP（Glial Fibrillary Acidic Protein）作为启动子，同时结合了绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的慢病毒（pGFAP-GFP）特异性感染小鼠海马DG区星形胶质细胞对小鼠脑电功率谱、HFOs数目和平均持续时间，以及 PILO造模时小鼠脑电和大发作的影响，以探究慢病毒作为基因转移载体在癫痫发病机制研究中的可应用性。
　　第一部分 PILO癫痫模型急性期小鼠脑电功率谱及HFOs的变化
　　此研究的目的是观察PILO癫痫模型急性期小鼠脑电功率谱及HFOs的变化，以及其与大发作之间的相关关系。实验中我们选取6周大C57BL/6小鼠，埋置颅骨电极，恢复两周后开始记录脑电，然后腹腔注射PILO（300 mg/kg）诱导痫性发作并同时记录急性期脑电。和PILO注射前相比，我们发现：1）无大发作出现的小鼠在低频（0.1-19 Hz和26-50 Hz）以及高频（80-500 Hz）的绝大部分频段功率谱都显著下降，且ripple和fast ripple的数目和平均持续时间都显著降低；2）有大发作出现的小鼠在低频（0.1-5 Hz和12-41 Hz）波段的功率谱都显著升高，而且ripple的数目和平均持续时间以及fast ripple的平均持续时间都显著升高，但高频（310-500 Hz）波段的功率谱降低，fast ripple的数目也减少。以上结果提示我们低频波段功率谱，ripple的数目和平均持续时间与大发作呈正向相关；3）PILO注射后无大发作小鼠在其慢性期痫性发作次数与急性期HFOs数目和平均持续时间相关系数均小于0.8，说明 PILO造模小鼠急性期 HFOs与其在慢性期痫性发作无显著相关关系；4）PILO注射后无大发作小鼠在其慢性期用PTZ诱导急性期无大发作小鼠痫性发作达到2级和4级发作的潜伏期与其急性期HFOs的数目和平均持续时间的相关系数均小于0.5，说明PILO造模小鼠急性期HFOs与其在慢性期PTZ易感性无显著相关关系；5）PILO注射后无大发作小鼠慢性期痫性发作前3-7 h与发作前1 h脑电中的HFOs变化无特定规律，提示PILO造模小鼠慢性期HFOs与其痫性发作无显著相关关系。
　　第二部分 pGFAP-GFP慢病毒海马内注射对小鼠脑电以及PILO造模时癫痫发作的影响
　　此部分研究检测了pGFAP-GFP慢病毒对小鼠脑电的影响。在培养细胞水平和脑切片水平验证了 pGFAP-GFP慢病毒对星形胶质细胞感染的特异性后，我们在小鼠海马 DG区注射pGFAP-GFP慢病毒，两周后开始进行小鼠脑电监测，发现：1）pGFAP-GFP慢病毒特异性感染海马DG区星形胶质细胞，而不感染成熟神经元；2）感染pGFAP-GFP慢病毒的小鼠体重与对照组相比无明显改变；3）pGFAP-GFP慢病毒的感染对小鼠脑电功率谱以及脑电中HFOs的数目和平均持续时间无明显影响；4）pGFAP-GFP慢病毒的感染不影响PILO腹腔注射导致的小鼠癫痫造模，包括脑电功率谱的变化以及大发作的潜伏期和发作比例。以上结果提示我们用此慢病毒作为基因转移载体研究星形胶质细胞在癫痫中的作用是可行的。

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缩略词（附录2）

第一章 绪论

1.1 癫痫

1.2 高频振荡（HFOs）与癫痫发生

1.3 基因治疗神经疾病

1.4 星形胶质细胞与癫痫发生

1.5 本课题研究目的及意义

第二章 PILO急性期小鼠脑电功率谱及HFOs的变化

2.1 实验材料

2.2实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 pGFAP慢病毒海马内注射对小鼠脑电以及PILO造模时行为发作的影响

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 全文总结

4.1 主要结论

4.2 研究展望

参考文献

致谢

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