尿毒症毒素对甲酚硫酸盐对动脉粥样硬化发生发展影响的研究

摘要

目的：
　　慢性肾病患者心血管疾病的发病率及其进展速度都远高于普通人群。与进展为终末期肾病相比，更多的轻中度慢性肾病患者死于心血管并发症。而这一现象又无法用传统危险因素在慢性肾病患者中高发这一原因来充分解释。因此，应有慢性肾病患者特有的心血管危险因素的存在。目前学者们将研究焦点转向了对甲酚硫酸盐这一蛋白结合型尿毒症毒素上。并且已有大量临床试验表明不同程度的慢性肾病患者体内对甲酚硫酸盐的升高均和心血管疾病相关。而且也有部分基础实验结果表明对甲酚硫酸盐可损伤血管内皮。因此，我们推测对甲酚硫酸盐可能与动脉粥样硬化发生发展有关。因此，本文拟通过临床、细胞及动物三个方面对这一假说进行验证。
　　方法：
　　1.在肾脏科血液透析门诊入选符合标准的200名血液透析患者。通过病史询问和病例资料查询，详细记录患者的基线资料。利用高效液相色谱分析(HPLC)的方法检测每位患者体内血清对甲酚硫酸盐的水平，并行颈动脉超声检查，根据超声结果将该200名患者分为颈动脉粥样斑块组（101名）和无颈动脉斑块组(99)名。分析对甲酚硫酸盐水平与颈动脉斑块的有无及面积大小的相关性。之后对上述患者进行为期5年的随访，最终有160人完成随访。5年后观察每位患者颈动脉斑块的进展情况，并分析其与血清对甲酚硫酸盐水平的相关性。
　　2.根据参考文献化学合成对甲酚硫酸盐。通过购买或者原代分离获取人脐静脉内皮细胞，人主动脉内皮细胞，人单核巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞。检测对甲酚硫酸盐对上述内皮细胞和巨噬细胞炎症水平及单核-内皮粘附的影响并检测NADPH氧化酶及ROS的产生在其中的作用。
　　3.利用灌胃的方法给予处于慢性肾病状态的APOE-/-小鼠对甲酚硫酸盐干预，观察其对动脉粥样硬化发生的影响，并观察NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃素是否会抑制对甲酚硫酸盐的这一作用。
　　结果：
　　1.多元Logistic回归显示，在行血液透析的患者中，血清对甲酚硫酸盐水平的升高是颈动脉粥样硬化斑块发生的独立危险因素。并且血清对甲酚硫酸盐的水平与患者颈动脉粥样斑块的面积呈正相关。且随访5年后该相关性依然存在。并且对甲酚硫酸盐水平和颈动脉斑块的进展正相关，多元线性回归分析表明对甲酚硫酸盐水平的升高是颈动脉粥样斑块进展的独立预测因子。
　　2.无论在蛋白水平还是mRNA水平，对甲酚硫酸盐均可刺激内皮细胞和巨噬细胞内炎症因子和细胞粘附因子的高表达，促进单核细胞向血管内皮的粘附，并且增加上述细胞内ROS的产生。而对甲酚硫酸盐的上述生物学效应均可被NADPH氧化酶抑制剂所抑制。
　　3.对甲酚硫酸盐促进APOE-/-小鼠主动脉粥样斑块的发生，促进其血管组织中炎症水平的升高及ROS产生增加。而上述表现在一定程度上可被NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃素所抑制。
　　结论：
　　1.血液透析患者血清中对甲酚硫酸盐水平与其颈动脉粥样斑块的发生发展有关。
　　2.对甲酚硫酸盐可刺激内皮细胞和巨噬细胞的炎症因子的表达，进而促进了动脉粥样硬化的发生，而这一现象可能与其通过促进NADPH氧化酶的高表达进而使ROS产生增加有关。
　　3.对甲酚硫酸盐可以通过促进NADPH氧化酶的高表达，ROS产生而促进APOE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生。

目录

声明

摘要

符号说明

绪论

第一部分 血清对甲酚硫酸盐水平与颈动脉粥样斑块发生发展的相关性研究

前言

材料和方法

1．诊断标准

2．研究对象

3．主要试剂和仪器

4．临床生化检测

5．血清对甲酚硫酸盐检测

6．颈动脉超声检测

7．统计方法

结果

1．临床基线特征

2．血清生物标记物分析

3．血清对甲酚硫酸盐与颈动脉斑块发生及面积大小的相关性分析

4．颈动脉粥样硬化斑块危险因素多元Logistic回归分析

5．对甲酚硫酸盐水平与颈动脉粥样斑块进展的相关性分析

讨论

第二部分 对甲酚硫酸盐对内皮细胞和巨噬细胞的体外作用研究

前言

材料与方法

1．实验仪器与耗材

2．实验试剂

3．对甲酚硫酸盐的合成

4．细胞实验方法

5．活性氧自由基(ROS)DCFH-DA检测

6．细胞蛋白的提取

7．蛋白浓度的测定

8．Western blot免疫印迹检测

9．Real-time PCR(实时荧光定量PCR)

10．体外单核细胞-内皮细胞的粘附实验

11．体内单核细胞-内皮细胞的粘附实验

12．血管氧化应激水平(ROS)的检测

13．血管NADPH氧化酶活性检测

14．统计分析

结果

1．对甲酚硫酸盐诱导内皮细胞和巨噬细胞炎症因子的高表达

2．对甲酚硫酸盐促进内皮细胞粘附分子的表达

3．对甲酚硫酸盐促进内皮细胞和巨噬细胞ROS的产生和NAPDH氧化酶的表达

4．对甲酚硫酸盐促进体内和体外内皮细胞与单核细胞的粘附，而该作用可被NADPH氧化酶抑制剂所逆转

讨论

第三部分 对甲酚硫酸盐对体内动脉粥样硬化形成的影响

前言

材料与方法

1．实验仪器与耗材

2．实验试剂

3．实验动物

4．实验设计

5．实验方法

结果

对甲酚硫酸盐促进APOE-／-小鼠动脉粥样硬化的发生，而这一效应可被NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃素减轻

对甲酚硫酸盐通过NADPH氧化酶促进慢性肾病小鼠体内ROS产生，炎症粘附因子的表达

讨论

全文总结

参考文献

致谢

博士期间发表论文