一株丝状真菌胞外中性纤维素酶系的分离纯化与酶功能的研究

摘要

纤维素生物质是自然界中存在最广泛的有机物质，通过其生物合成和生物降解来保持生物圈的碳循环。近年来，由于化石能源供应不稳定，环境与生态平衡遭到破坏，以及全球气候的急剧变化，使生物质资源转化及纤维素酶新工艺开发具有了重要的战略意义。在纤维素生物质转化及纤维素酶应用的过程中，丝状真菌由于具有高效的胞外蛋白质分泌系统，产纤维素酶量大、酶活力高，发挥着重要作用。近十年来，丝状真菌所产中性纤维素酶由于高效优质的处理工艺和较小的环境压力，在纺织工业中得到了广泛应用。但是，目前国内关于该类菌株的研究工作很少，开发具有知识产权的高效中性纤维素酶具有重要意义。 本实验室从秸秆青贮饲料中筛选到一株丝状真菌，该菌株产胞外纤维素酶为中性酶，最适pH值在6.5左右，在pH值8.0-10.0范围内能够保持60％-50％的酶活力，经鉴定为黑葡萄穗霉属(Stachybotrys)一个新种，命名为Stachybotrys sp.S05。其胞外纤维素酶表达受纤维素底物、麸皮、玉米芯、Ca2+诱导，而以葡萄糖等还原性糖作为碳源时本底表达水平低；通过液体发酵条件优化，其最适产酶条件添加麸皮4.0％、玉米芯2.5％，在该条件下细胞外纤维素酶系总CMCase酶活达到2.04IU/mL，最适反应温度50℃。同时，Stachybotrys sp.S05胞外滤纸酶和木聚糖酶均为中性酶，在pH值6.5时二者活力分别达到10.0IU/mL和12.0IU/mL。通过Sephadex G25、DEAE-Sepharose Fast Flow、Bio gel P100、HPLC等方法，对Stachybotrys sp.S05胞外内切酶系进行了分离纯化，得到内切酶组分EG1，其分子量分别约为40.0kDa；EGI为主要内切酶活组分，其最适pH值在6.0左右，最适温度50℃，室温下酶活力稳定。利用MALDI-TOF MS鉴定了EGI肽序列特征，并对Stachybotrys属内切酶序列功能进行了生物信息学分析。 本论文开展的Stachybotrys sp.S05研究工作，为该菌株中性纤维素酶在纺织工业应用的研究提供了理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：Abbreviation

声明

第1章背景——纤维素酶及丝状真菌研究

1.1、纤维素酶研究历史及当前契机

1.2、微生物与纤维素酶

1.2.1、纤维素酶分类

1.2.2、产纤维素酶微生物

1.2.3、细菌纤维素酶系——纤维小体

1.2.4、真菌纤维素酶系

1.2.5、纤维素酶序列、结构与功能简析

1.3、纤维素酶工业应用及前景

1.4、纤维素酶与丝状真菌表达体系

1.4.1、丝状真菌工业发酵及表达体系

1.4.2、丝状真菌模式菌株基因组分析

1.4.3、丝状真菌分泌性蛋白的表达体系

1.4.4、丝状真菌与安全生产

1.5、论文立题依据和内容概述

第2章纤维素高效降解菌株的分离纯化与鉴定

2.1、材料与方法

2.1.1、菌株

2.1.2、培养基

2.1.3、主要仪器与试剂

2.1.4、菌株的筛选、纯化与形态鉴定

2.1.5、基因组DNA提取（CTAB法）

2.1.6、18S rRNA基因克隆及引物序列

2.1.7、ITS基因克隆及引物序列

2.1.8、PCR产物与测序载体的连接及测序

2.2、结果与分析：

2.2.1、菌株纯化与形态鉴定

2.2.2、分子生物学鉴定

2.3、讨论

第3章Stachybotrys sp.S05发酵条件的优化及胞外纤维素酶性质

3.1、材料与方法

3.1.1、菌株

3.1.2、培养基及其优化方案

3.1.3、孢子悬液的制备方法

3.1.4、酶活力测定缓冲体系

3.1.5、还原糖含量测定

3.1.6、胞外纤维素酶及木聚糖酶活力测定

3.1.7、SDS-PAGE与活性电泳（CMC-SDS-PAGE）

3.2、结果与分析

3.2.1、固体平板培养

3.2.2、液体发酵条件优化及酶液性质

3.2.3、固态发酵条件分析

3.2.4、固体发酵胞外纤维素酶表达谱初步分析

3.2.5、木聚糖酶性质分析

3.3、讨论

第4章Stachybotrys sp.S05胞外内切酶系分离纯化及性质鉴定

4.1、材料与方法

4.1.1、主要仪器与试剂

4.1.2、胞外酶液发酵及预处理

4.1.3、分离纯化流程

4.1.4、Sephodex G-25分子筛柱层析

4.1.5、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析

4.1.6、Bio gel P-100分子筛柱层析

4.1.7、HPLC高效液相柱层析

4.1.8、胞外酶最适反应条件测定

4.1.9、蛋白质含量测定—Bradford法

4.1.10、SDS-PAGE与活性电泳（CMC-SDS-PAGE）

4.1.11、酶分子MALDI-TOF MS肽指纹图谱鉴定

4.2、结果与分析

4.2.1、胞外酶液发酵条件分析

4.2.2、内切酶系分离纯化

4.2.3、内切酶EGI酶学性质

4.2.4、质谱鉴定结果讨论

4.3、讨论

第5章Stachybotrys属纤维素酶分子生物学研究

5.1、材料与方法

5.1.1、RNA提取培养基

5.1.2、总RNA的提取

5.1.3、RT-PCR及cDNA测序

5.1.4、EGI生物信息学分析

5.2、结果与分析

5.3、讨论

第6章总结与展望

6.1、本论文总结及创新点

6.2、存在的问题及展望

附 录

References

论文致谢