血管加压素对健康雄性大鼠近端结肠离体肌条收缩活动的影响及其机制研究

摘要

血管加压素(AVP)是由神经垂体分泌的九肽激素，主要的生理作用是收缩血管和抗利尿。AVP受体属于G-蛋白偶联的膜受体，包括V1血管受体(V1Rs)、V2肾脏受体(V2Rs)和V3垂体受体(V3Rs)三个亚型。AVP作为一种非肾上腺素能缩血管物质，已广泛应用于临床治疗，为危重病人提供血压支持或抑制胃肠道出血等。但该治疗方法常伴有消化道损伤，这可能与AVP减少组织灌流引起缺血性组织损伤或影响消化道平滑肌收缩功能有关。
　　 已有报道证明AVP受体在人胃肠道上广泛表达。AVP对胃肠道动力的影响存在浓度依赖性，且存在种属间差异。生理水平的AVP不改变大鼠和人结肠平滑肌收缩，但外源性AVP或应急状态下血液中AVP浓度增高对消化道运动的影响及其机制尚不明确。
　　 我们前期的研究发现静脉注射AVP引起大鼠结肠收缩减弱。一氧化氮(NO)是胃肠道平滑肌主要的舒张因子，由一氧化氮合酶(NOS)催化底物L-精氨酸分解生成。NO在消化道各部分生理病理功能调节中起到重要作用，影响食管下部括约肌、幽门、Oddi括约肌和肛门等处平滑肌张力，参与肠蠕动反射。大量研究证明NOS抑制剂可以延迟胃排空和阻碍结肠运动。细胞内NOS蛋白表达下降引起局部NO量合成减少可能与多种消化道动力异常有关。有研究提示AVP促进心肌纤维原细胞生成NO，因此我们推测AVP可能通过激活一氧化氮合酶(NOS)，增加NO释放而抑制结肠平滑肌收缩。本研究将对以上假设进行验证。
　　 材料与方法：
　　 实验动物
　　 实验选用雄性Wistar大鼠，体重约为280 g～320 g，实验前禁食12 hr，自由饮水。
　　 离体肌条制备
　　 快速牺牲大鼠，距回盲部1 cm处取近端结肠组织。沿肠系膜方向将肠管剪开，用Krebs液反复冲洗后，黏膜面朝上固定在石蜡盘中，盘内持续通有95％O2和5％CO2的混合气体。用眼科剪仔细去除黏膜。沿垂直于肠轴方向将组织剪裁为8×3 mm大小的近端结肠环行肌条。
　　 离体肌条收缩活动记录
　　 将处理好的肌条放置于灌流浴槽中。浴槽内盛有5 ml37℃krebs液和持续通有95％O2和5％CO2的混合气体。肌条一端固定在浴槽底部的玻璃弯钩上，另一端与张力换能器相连。肌条收缩活动以张力信号形式输入生理记录仪。肌条在1 g的前负荷下孵育60 min，每隔15 min换用新鲜的37℃krebs液冲洗，待其自发收缩稳定后开始实验。每个环行肌条只接受一次AVP处理。加药后，连续记录肌条收缩活动30 min。在需要用阻断剂预处理的实验中，肌条先用阻断剂孵育10 min～30 min，然后再加入AVP处理。所用阻断剂包括[deamino-Pen1，O-Me-Tyr2，Arg8]-Vasopressin(V-1880，V1受体(V1 Rs)阻断剂)，Pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC，NF-κB阻断剂)，N(G)-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME，NOS非特异性阻断剂)，S-methylisothioure(SMT，iNOS特异性阻断剂)，tetrodotoxin(TTX，河豚毒素)和N-Propyl-L-Arginine(NPLA，nNOS特异性阻断剂)。
　　 免疫组化
　　 取大鼠近端结肠组织，用4％多聚甲醛固定后，石蜡包埋，制成厚4μm的切片。石蜡切片经脱蜡、水化处理，再用3％H2O2孵育10 min，以灭活其中内源性过氧化物酶。磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冲洗三次，5％牛血清封闭1 hr，然后加兔抗iNOS(1:200)抗体或羊抗V1Rs抗体(1:100)4℃过夜。PBS冲洗，滴加生物素标记的二抗工作液室温孵育30 min。冲洗后，滴加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记链酶卵白素工作液室温孵育30 min。PBS冲洗三次，最后用3，3-二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)镜下显色，苏木素复染。PBS代替一抗孵育切片作为阴性对照。
　　 免疫荧光双标
　　 V1Rs和NeuN
　　 制备大鼠近端结肠石蜡切片。5％牛血清封闭后，同时滴加羊抗V1Rs多克隆抗体(1:100)和小鼠抗神经元细胞核(neuronal nuclei，NeuN)单克隆抗体(1:100)。将切片置于湿盒内，4℃过夜。PBS冲洗后，同时滴加四甲基异氰酸罗达明(TRITC)兔抗羊IgG(1:50)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记兔抗小鼠IgG(1:50)，室温孵育1 hr。
　　 V1Rs和iNOS
　　 实验步骤同前，使用的一抗为羊抗V1Rs多克隆抗体(1:100)和兔抗iNOS多克隆抗体(1:200)。使用二抗为FITC标记驴抗羊IgG(1:50)和TRITC标记驴抗兔(1：50)。
　　 荧光显微镜下观察免疫阳性细胞，拍照。
　　 细胞核蛋白/浆蛋白的提取
　　 取大鼠近端结肠环行肌条，经AVP或生理盐水(NS)处理5 min后，加入细胞浆蛋白抽提试剂A匀浆。将匀浆液剧烈震荡，4℃离心，吸取上清即为抽提得到的细胞浆蛋白液。随后，完全吸尽残余的上清，沉淀内加入50μl添加了苯甲基磺酰(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的细胞核蛋白抽提试剂B，4℃震荡30 min，4℃，12000 g离心10 min，吸取上清即为抽提得到的细胞核蛋白。
　　 Western Blot
　　 用蛋白浓度测定试剂盒对以上蛋白提取液进行定量分析。电泳结束后用湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，室温下5％脱脂奶粉封闭1 hr，TTBS(Tris Buffer Saline withTween-20)多次冲洗。使用兔抗iNOS(1:500)、兔抗NF-κB(P65)(1:500)或兔抗Ⅰ-κB(1：800)一抗孵育4℃过夜。TTBS冲洗，室温下辣根过氧化物酶标记的二抗(1:20000)孵育1hr。ECL显影。
　　 NO含量的测定
　　 取大鼠近端结肠环行肌条，去黏膜，经AVP(10-8 mol/L)或生理盐水(NS)处理5min后匀浆。匀浆液在4℃离心5 min(4000 g)后，取50μl上清液与Griess试剂Ⅰ和Ⅱ室温混合孵育。酶标仪560 nm测定其吸光度。
　　 统计分析
　　 离体肌条实验：实验中持续记录肌条等长收缩。定量分析时，软件对曲线下面积每10s做一次积分，1 min内积分总和与时间(60 s)的比值则为该时间段内的肌条平均张力。加药前肌条平均张力值作为参考值，并标准化为1；加药后肌条平均张力值与该参考值的比值为R值。
　　 Western Blot：应用Scion Image分析软件进行蛋白定量分析。内参蛋白(胞核蛋白，c-jun；胞浆蛋白，β-actin)的灰度值标准化为100％，目的蛋白的灰度值与内参蛋白的灰度值之比为统计指标。
　　 所有数据均采用均数±标准误表示，采用单因素方差分析和t检验进行统计学处理，以P<0.05为显著性差异界值。
　　 结果：
　　 (1)AVP对大鼠近端结肠环行肌收缩的影响。孵育液中加入AVP(10-8 mol/L)后环行肌收缩明显减弱，加药后5 min肌条张力降至最低，R值降为0.63±0.06(P<0.05，n=13)然后逐渐恢复，在12 min恢复至0.86±0.03(P>0.05，n=13)。外源性AVP(10-10～10-3mol/L)使肌条自发收缩减弱，且该作用呈剂量-反应关系。当AVP浓度低至10-11 mol/L时AVP不影响肌条收缩。V1Rs特异性阻断剂V-1880(10-7 mol/L)可以消除AVP(10-8mol/L)对肌条收缩的抑制作用。V-1880(10-7 mol/L)本身对肌条收缩活动无明显影响。
　　 (2)NOS抑制剂的作用。L-NAME(NOS非特异性阻断剂，10-4 mol/L)和NPLA(nNOS特异性阻断剂，10-7 mol/L)能够增强大鼠结肠环行肌条自发性收缩，而SMT(iNOS特异性阻断剂，10-3mol/L)对肌条收缩无影响。肌条用生理盐水(NS)、L-NAME(10-4mol/L)或NPLA(10-7mol/L)处理5 min后，其R值分别为0.91±0.02(n=15)、1.02±0.06，(n=15，P<0.05)和0.99±0.01，(n=15，P<0.05)。L-NAME(10-4 mol/L)、NPLA(10-7 mol/L)或SMT(10-3 mol/L)均明显减弱AVP对肌条收缩的抑制作用。
　　 (3)肠神经系统的作用。TTX(河豚毒素)本身能够兴奋大鼠结肠环行肌收缩。肌条浴液中加入TTX(10-5 mol/L)5 min后，张力R值从0.91±0.02(对照组)升高到1.07±0.04。TTX(10-5 mol/L)预处理后再加AVP，AVP抑制环行肌条收缩的作用明显减弱。
　　 (4)AVP对iNOS表达和NO产生的影响。AVP(10-8 mol/L)处理肌条后，其iNOS表达和NO生成量明显增加。肌条用AVP(10-8 mol/L)处理后5 min，组织中NO浓度由13.72μmol/L±0.6μmol/L(对照组)增加到为23.76μmol/L±0.9μmol/L(P<0.05，n=6)，组织内iNOS蛋白表达量高于对照组2.09±0.6倍(P<0.05，n=4)。阻断剂SMT预孵育能够抑制AVP(10-8 mol/L)增加肌条合成NO的作用。NF-κB阻断剂PDTC预孵育能够抑制AVP(10-8 mol/L)诱导的肌条iNOS表达上调，减弱AVP对肌条收缩的抑制。
　　 (5)AVP对NF-κB活性的影响。肌条组织经AVP(10-8 mol/L)孵育5 min后胞浆内Ⅰ-κB表达明显减少，而胞核内NF-κB(P65)表达增加。AVP(10-8mol/L)处理肌条5 min后用Western blot测蛋白表达量变化，加药组与对照组相比其胞浆内Ⅰ-κB蛋白量减少了26.3％±5.36％(P<0.05，n=4)，而胞核内NF-κB表达增加了4.3±0.4倍(P<0.05，n=6)。使用PDTC(10-3 mol/L)预处理后AVP不再影响胞浆内Ⅰ-κB和胞核内P65表达。
　　 (6)免疫荧光定位V1Rs和iNOS。V1Rs阳性细胞位于正常大鼠近端结肠肠神经丛内。免疫荧光双标证实V1Rs和NeuN共同表达与肌间神经元。AVP(10-7 mol/L)处理5 mim后结肠组织iNOS阳性细胞位于肌间神经丛内，而用生理盐水(NS)处理的样本内并无iNOS表达。免疫荧光双标结果证实iNOS与V1R共同表达于肌间神经元。
　　 结论：
　　 AvP能够抑制大鼠近端结肠环行肌收缩，此作用是通过激活肠肌间神经元中的NF-κB-iNOS和nNOS两条通路引起NO生成增多而实现的。