脂肪干细胞在治疗2型糖尿病膀胱功能障碍大鼠模型中的研究

摘要

研究背景：
　　 糖尿病包含两种基本类型，1型糖尿病常继发于胰岛β细胞的自身免疫损伤，2型糖尿病(typeⅡdiabetesmellitus，DMⅡ)在新发病例中占据大多数，最初表现为胰岛素抵抗，随着胰岛素需求量的增高，胰岛慢慢衰竭，导致血糖升高。糖尿病的并发症包括心脏病变，高血压，视网膜病变，神经病变，肾脏病变等。在泌尿系统的并发症中，膀胱功能障碍非常普遍，在糖尿病病人中大约占80％，临床症状主要表现为膀胱粘膜感觉受损，残余尿增多以及逼尿肌过度活动症。尽管糖尿病膀胱功能障碍并不危及生命，但严重影响了病人的生活质量，并且目前尚无有效的治疗方式。传统的治疗方法，例如药物治疗和手术治疗，由于效果欠佳，易复发，术后易导致排尿困难等原因很少采用。脂肪来源干细胞(adiposetissuederivedstemcells，ADSCs)是一种在脂肪组织血管周围发现的间充质干细胞，类似于骨髓间充质干细胞，具备多向分化的能力。在既往的实验研究中，研究人员发现ADSCs在能够促进肥胖致下尿路症状的恢复，能够修复大鼠受损的盆腔神经节，能够促进海绵体神经受损致勃起功能障碍的修复，并且由于ADSCs存量丰富并且易获取，其已经成为应用研究前景广阔的组织修复材料。尽管在动物实验中发现，移植的ADSCs能够分化成为受损处的组织细胞类型，但目前认为旁分泌途径是ADSCs发挥治疗作用的主要途径。将ADSCs裂解液注入双侧海绵体神经受损的大鼠阴茎海绵体后，勃起功能较对照组有明显改善就很好的支持了上述观点。
　　 目的：
　　 制造DMⅡ膀胱功能障碍的大鼠模型，探讨ADSCs移植在糖尿病膀胱功能障碍中的治疗作用及治疗机制。
　　 材料与方法：
　　 1.动物实验
　　 (1)实验设计
　　 39只雌性8周龄的Sprague-Dawley大鼠，随机分组如下:
　　 正常对照组:喂养普通食物(n=10只);
　　 糖尿病组:首先喂养高脂肪食物1个月，然后腹腔注射两次低剂量的链脲佐菌素(30mg/kg，streptozotocin，STZ)，高脂肪食物继续喂养至实验结束(n=29只)。
　　 STZ腹腔注射3个月后所有实验大鼠进代谢笼检测并行胰岛素抵抗检测，然后行腹腔手术取出脂肪组织进行ADSCs的分离和增殖培养，并用10μM5-ethynyl-2-deoxyuridine(EdU)标记。
　　 然后向正常对照组大鼠的膀胱壁注射1ml平衡盐溶液(N+PBS组，n=10只)，糖尿病组中的29只大鼠随机分为3组:
　　 第1组:膀胱壁注射1ml平衡盐溶液(DM+PBS组，n=9只);
　　 第2组:通过尾静脉注射自体ADSCs(DM+T组，n=10只);
　　 第3组:膀胱壁注射自体ADSCs（DM+B组，n=10只）。ADSCs移植1月后，对所有大鼠进行清醒状态下膀胱内压的检测，最后处死进行组织学检查。
　　 (2)代谢笼检测
　　 STZ注射3个月后，所有大鼠行24h代谢笼检测实验，所有大鼠在代谢笼中均自由饮食，它们的尿的频率和尿量经过计算机软件记录。
　　 (3)胰岛素抵抗实验
　　 代谢笼检测完毕后，所有的实验大鼠进行胰岛素抵抗实验的检测。通过腹腔注射1IU/Kg胰岛素，然后在0，15，30，60，90和120分钟分别检测大鼠血糖值。
　　 (4)ADSCs的分离培养、标记并注射
　　 采用酶消化法将ADSCs从脂肪分离，并在DMEM低糖培养基中，在37℃，5％CO2的细胞培养温箱内培养。注射前在含有10μMEdU的培养基中过夜标记。然后向N+PBS组和DM+PBS组大鼠膀胱壁内注射1ml的平衡盐溶液，向DM+B组大鼠膀胱壁内注射3x106个ADSCs，向DM+T组大鼠尾静脉内注射3x106个ADSCs。
　　 (5)清醒状态膀胱内压测定
　　 ADSCs移植1月后，对所有实验大鼠进行清醒状态下膀胱内压的检测。第1条聚乙烯-90导管置入膀胱检测膀胱内压，第2条导管置入腹腔检测腹内压，待膀胱活动稳定后持续检测1小时。
　　 (6)血生化的检测
　　 大鼠处死后，利用含肝素的离心管收集1ml从下腔静脉抽取的血液，离心后收集上层血浆。然后利用酶联免疫反应试剂盒分别检测血浆胰岛素、甘油三酯、高密度脂蛋白、低/极低密度脂蛋白的浓度。
　　 (7)免疫荧光染色和免疫组化染色
　　 大鼠膀胱组织经2％冰甲醛固定4小时后进行包埋并且进行冰冻切片，切片风干后进行免疫荧光染色和免疫组化染色。一抗包括小鼠抗平滑肌肌动蛋白抗体(smoothmuscleactin，SMA)，兔抗胶原蛋白Ⅳ抗体(CollagenⅣ,ColⅣ)，羊抗尿路上皮跨膜蛋白Ⅱ抗体(UroplakinⅡ，UPⅡ)，小鼠抗大鼠内皮细胞抗原-1抗体(ratendothelialcellantigen-1，RECA-1)，小鼠抗基质细胞衍生因子-1抗体(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1)。然后，RECA-1的染色经过抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术(avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC)完成。其余染色经结合Alexafluor488或者Texasred的二抗孵育。另外，SMA染色也经过鬼笔环肽(Phalloidin)室温下孵育20分钟完成。我们利用Click-IT反应试剂盒染色来追踪EdU标记的ADSCs。
　　 (8)膀胱组织细胞凋亡的定量及EdU标记ADSCs在膀胱组织中的定量
　　 膀胱组织切片中凋亡细胞染色采用TUNEL试剂盒，TUNEL染色后在荧光显微镜下利用ImageProPlus软件计算凋亡细胞的数目。
　　 EdU标记ADSCs在膀胱组织中的定量是通过计算ADSCs在一个组织切片中的数目与膀胱可切切片数目的乘积获得。
　　 2.细胞实验
　　 (1)条件培养基的制备
　　 将大鼠ADSCs种植于含10％胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)的DMEM培养基中，当覆盖率达90％后，将培养基置换为不含血清的DMEM，24小时后收集培养基，离心后-80℃保存备用。大鼠阴茎平滑肌细胞(penilesmoothmusclecells，PSMCs)条件培养基作为阴性对照。人ADSCs和PSMCs条件培养基制备方法同上。
　　 (2)大鼠ADSCs分泌血管内皮生长因子的定量
　　 利用酶联免疫反应(ELISA)检测大鼠ADSCs条件培养基中血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的含量，大鼠阴茎平滑肌细胞条件培养基作为阴性对照。
　　 (3)人脐静脉内皮细胞，大鼠膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞的培养
　　 将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植于6孔细胞培养板内，然后分别加入4种不同的培养基培养48小时:正常葡萄糖含量的普通培养基(NG组)，高糖的普通培养基（HG组），高糖的人阴茎平滑肌细胞的条件培养基(HG+PSMCsCM组)，高糖的人ADSCs的条件培养基（HG+ADSCsCM组）。同上，利用大鼠阴茎平滑肌细胞和ADSCs的条件培养基培养大鼠膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞。
　　 (4)毛细血管样管形成实验
　　 将上述培养的HUVECs种植在预先用低生长因子基质胶覆盖的12孔板内，并继续用上述不同的培养基培养16小时。然后在显微镜下观察各组毛细血管样管形成的数量。
　　 (5)培养细胞中发生凋亡的检测
　　 上述培养的大鼠膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞用TUNEL试剂盒进行染色，然后在荧光显微镜下观察凋亡细胞发生的情况。同时利用流式细胞仪对凋亡细胞进行定量检测。
　　 (6)RNA提取和实时定量PCR
　　 上述培养的大鼠膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞中的RNA利用RNAeasyIsolation试剂盒进行提取。逆转录后，大鼠Caspase-3基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)利用AppliedBiosystems'PRISM7300HT序列检测系统进行实时定量PCR的检测。
　　 3.统计学分析
　　 使用Prism5软件对各组实验数据进行统计学检验。各组之间连续性数据的比较使用单因素方差分析检验。Post-hoc比较使用Tukey-Kramer检验。利用Fisher卡方精确检验比较各组中ADSCs移植后膀胱功能改善情况。p＜0.05表示具有显著性差异。所有数值用平均值±标准差表示。
　　 结果：
　　 1.2型糖尿病大鼠模型制造
　　 糖尿病组中的大鼠平均体重较正常对照组明显增加，胰岛素敏感性下降，血浆胰岛素轻微下降，血糖明显升高。代谢笼检测结果显示糖尿病组大鼠的24h饮水量，排尿次数，每次排尿量较正常对照组显著增高(p＜0.001)。
　　 2.清醒状态膀胱内压测定
　　 N+PBS组中的大鼠(n=10)表现为正常的排尿曲线，每30分钟排尿8-9次，排尿时膀胱内压峰值38.9±9.3cmH2O，每次排尿0.4±0.14ml。部分DM+PBS组中的大鼠(n=6)排尿曲线异常，表现为每30分钟排尿1-2次，排尿时膀胱内压峰值50.0±10.8cmH2O，每次排尿3.74±1.09ml。另外，1只DM+PBS组中的大鼠(n=1)表现为无收缩性排尿曲线，2只DM+PBS组中的大鼠(n=2)，2只DM+T组中的大鼠(n=2)，1只DM+B组中的大鼠(n=1)表现为不稳定膀胱排尿曲线。在注射ADSC的大鼠中，分别有40％的DM+T组中的大鼠和60％的DM+B组中的大鼠的排尿曲线表现为正常曲线，较DM+PBS组(0％)有显著升高(p＜0.05)。
　　 3.EdU阳性细胞的追踪
　　 在ADSC注射1个月后，EdU染色结果发现在膀胱粘膜下层组织和肌层中存在EdU阳性的细胞。其中部分EdU阳性细胞表现为SMA阳性。在DM+T组中，肌层与粘膜下层EdU阳性的细胞数目分别为4.7±2.1×103和10.2±3.8×103。在DM+B组中，肌层与粘膜下层EdU阳性的细胞数目分别为5.6±2.9×103和14.9±5.0×103。DM+T组中大鼠膀胱组织中可见SDF-1阳性细胞。
　　 4.细胞凋亡的定量
　　 在膀胱组织切片中，细胞凋亡主要发生在膀胱粘膜层和肌层。DM+PBS组中的细胞凋亡数目明显多于N+PBS组(p＜0.05)。ADSC注射后，粘膜层细胞凋亡数目显著减少(p＜0.05)，而肌层细胞凋亡数目没有明显改变(p＞0.05)。
　　 在培养的大鼠尿路上皮细胞中，流式细胞术结果显示HG组中发生凋亡的细胞比例（30.3％±9.9％）较NG组中（5.1％±0.8％）显著升高(p＜0.001)。HG+ADSCsCM组中发生凋亡的细胞比例（10.1％±2.7％）较HG组显著下降(p＜0.001)。HG+PSMCsCM组中发生凋亡的细胞比例（33.4％±8.1％）与HG组无显著差别(p＞0.05)。
　　 在培养的大鼠膀胱平滑肌细胞中，流式细胞术结果显示HG组中发生凋亡的细胞比例（19.1±4.9％）较NG组中（1.6±0.7％）显著升高(p＜0.001)。HG+ADSCsCM组中发生凋亡的细胞比例（10.3±4.6％）较HG组显著下降(p＜0.05)。HG+PSMCsCM组中发生凋亡的细胞比例（20.0±9.8％）与HG组无显著差别(p＞0.05)。
　　 实时定量PCR结果显示，培养的大鼠尿路上皮细胞中，HG组的Caspase-3表达量较NG组显著升高(p＜0.001)，HG+ADSCsCM组较HG组显著降低(p＜0.01)，HG+PSMCsCM组与HG组无显著差别(p＞0.05）。培养的大鼠膀胱平滑肌细胞中，HG组的Caspase-3表达量较NG组显著升高(p＜0.01)，HG+ADSCsCM组较HG组显著降低(p＜0.05)，HG+PSMCsCM组与HG组无显著差别(p＞0.05)。
　　 5.血管密度的定量
　　 在正常大鼠膀胱的粘膜下层可见连续致密的ColⅣ阳性的毛细血管网络。而在DM+PBS组中，此毛细血管网络失去连续性，数目减少或缺失。在DM+T和DM+B组中，毛细血管网络的连续性较ADSCs注射前明显改善。与DM+PBS组相比，N+PBS组，DM+T组和DM+B组中膀胱粘膜下层可见大量的RECA-1阳性细胞。
　　 ELISA结果显示ADSCs条件培养基中（652.1±140.3pg/ml）VEGF的含量较对照细胞PSMCs条件培养基中（348.8±96.7pg/ml）显著增加(p＜0.05)。
　　 毛细血管样管形成实验结果显示，HG+ADSCsCM组中HUVECs形成毛细血管样管的能力较HG组显著增加(p＜0.01)，而HG+PSMCsCM组无明显改变(p＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.成功建立了DMⅡ膀胱功能障碍的大鼠模型，并且此模型表现的生理特征和膀胱功能受损情况与晚期DBD相似。
　　 2.ADSCs能够促进大鼠模型膀胱功能的恢复。
　　 3.ADSCs可以通过其分化功能（如分化为SMCs）发挥治疗作用，但是最主要的途径为旁分泌功能。
　　 4.抑制细胞凋亡和促进血管形成是ADSCs治疗过程中的重要的反应。
　　 意义：
　　 本项研究首次在2型糖尿病大鼠模型中，利用移植ADSCs的方法来治疗糖尿病导致的膀胱功能障碍，结果表明ADSCs主要通过旁分泌的途径，促进血管形成，抑制细胞凋亡，从而促进膀胱功能的修复。本项研究为ADSCs在膀胱功能修复医学中的研究与应用打下了基础。