骨髓间充质干细胞预处理对LPS诱导大鼠DIC模型的器官保护作用

摘要

研究目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)预处理对脂多糖(LPS)诱导弥漫性血管内凝血(DIC)模型大鼠的器官保护性作用并探讨其机制。
　　 研究方法:
　　 第一部分:取同种异体Wistar大鼠原代骨髓间充质干细胞进行传代培养。对培养出的骨髓干细胞进行形态观察，考察其增殖能力;通过流式细胞仪对其细胞表型进行鉴定;在特定条件下培养BMSCs向内皮细胞，成骨细胞，脂肪细胞的分化，以证实其潜在可塑性，进一步确定其为BMSCs。
　　 第二部分:LPS诱导Wistar大鼠DIC模型的建立。30只成年雄性Wistar大鼠，月龄7周，体重160-170g，分为2组，实验组和对照组各15只，按剂量30mg/kg腹腔内注射异戊巴比妥钠麻醉后，实验组经尾静脉或股静脉缓慢注射2mlLPS(3mg/kg，1小时)，而对照组给予等量生理盐水。深麻醉下分别在LPS注射前及注射后4小时和8小时经下腔静脉抽取静脉血，测定以下凝血参数:血小板(PLT)数量，纤维蛋白原(Fib)，部分凝血活酶时间(APTT)，凝血酶原时间(PT)，D-2聚体(D-D)。在LPS注射8小时后处死大鼠。取实验组及对照组大鼠心脏，肝脏，肾脏，肺等主要器官的组织用10％甲醛固定24h，分别行HE染色和Mallory磷钨酸苏木精染色（PTAH染色），显微镜下观察各脏器细胞形态，纤维血栓形成情况，并进行对比;同时计数100个肾小球，观察其中有纤维蛋白微血栓的肾小球所占比例，以判断本组实验LPS能否成功诱导建立DIC模型。
　　 第三部分:慢病毒介导GFP转染骨髓间充质干细胞及体内检测。慢病毒载体(PGCL-GFP、pHelper1.0、pHelper2.0)包装后获取病毒的上清液保存。取第3代生长状态良好的大鼠BMSC5×104个，分别与0.25、2.5、5、12.5、25感染复数(MOI)的病毒液，在Polybrene液中(8g/ml)，32℃，1000g离心2小时，然后种于12孔板培养，每孔含10％FBS的DMEM1.5ml;12h后换液，此后每3天换液1次并观察BMSCs荧光表达情况;第5天每个孔取5个视野计算平均转染率，了解MOI与转染效率的关系，选择最佳MOI。取月龄7周，体重160-170g成年雄性Wistar大鼠10只，经大鼠尾静脉或股静脉注入1ml培养液（含有GFP标记转染5天后BMSCs数量约1×106）共3次，每次间隔24h，第3次注射24h后处死大鼠，取大鼠心脏组织，用10％甲醛固定24h，然后行HE及抗GFP过氧化物酶染色。观察心肌组织内是否有BMSCs存活。
　　 第四部分:上述实验成功后，取60只成年雄性Wistar大鼠，月龄7周，体重160-170g，按照BMSCs预处理和LPS注射方案不同分为6组，每组各有大鼠10只。处理组1:1ml培养液（不含BMSCs）注射3次，每次间隔24小时，进行预处理。在最后一次预处理结束后24h，注射1mlLPS(剂量，3mg/kg)。处理组2:1ml培养液（含BMSCs1×103）注射3次，每次间隔24小时，进行预处理。在最后一次预处理结束后24h，注射1mlLPS(剂量，3mg/kg)。处理组3:1ml培养液（含BMSCs1×104）注射3次每次间隔24小时，进行预处理。在最后一次预处理结束后24h，注射1mlLPS(剂量，3mg/kg)。处理组4:1ml培养液(含BMSCs1×105)注射3次每次间隔24小时，进行预处理。在最后一次预处理结束后24h，注射1mlLPS(剂量，3mg/kg)。处理组5:1ml培养液（含BMSCs1×106）注射3次，每次间隔24小时，进行预处理。在最后一次预处理结束后24h，注射1mlLPS(剂量，3mg/kg)。对照组:1ml培养液，不含BMSCs，注射3次，每次间隔24小时。在最后一次注射后24h，注射生理盐水1ml（不含LPS）。共6组。分别在LPS（或不含LPS）注入前及注入后4小时和8小时各抽取静脉血，测量以下参数:PLT，Fib，D-2聚体(D-D)，APTT，PT，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，干扰素-γ(IFN-γ)，白细胞介素-1β(IL-1β)，肌酐(Cr)，丙氨酸转氨酶(ALT)，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)，内皮素(ET)。取心脏，肝脏，肾脏及肺部组织进行HE染色及PTAH染色，检测各器官组织细胞形态及微纤维血栓形成情况。为了进一步证明BMSCs预处理对LPS诱导DIC大鼠的保护作用，我们选择另外60只成年雄性Wistar大鼠，月龄7周，体重160-170g，随机分为三组，观察短期内大鼠死亡事件。为更好观察短期内大鼠死亡事件，我们加大LPS注射剂量至10mg/kg，观察24小时内BMSCs预处理对LPS诱导DIC的保护作用。第1组:LPS注射，(LPS10mg/kg);第2组:BMSCs预处理，（1×103/次×3次，每次间隔24小时）+LPS注射（10mg/kg，在BMSCs最后一次预处理结束后24h进行）。第3组:BMSCs预处理，（1×105/次×3次，每次间隔24小时）+LPS注射（10mg/kg，在BMSCs最后一次预处理结束后24h进行）。BMSCs经股静脉注入，LPS行腹腔注射。观察LPS注射后24h内各组大鼠生存情况，统计各组死亡时间，行统计学生存分析，绘制生存曲线。
　　 第五部分:为进一步明确BMSCs预处理的保护机制，我们对不同剂量BMSCs预处理后大鼠外周血淋巴细胞(PBMC)增殖能力的影响进行了测定，并在体外环境下研究了不同剂量同种异体BMSCs对LPS刺激PBMC增殖的影响，以及对炎性细胞因子产生的影响。
　　 结果:1，第1-5天，细胞快速生长，是增殖最快的时期，约第6天BMSCs增值达到顶峰，此后维持小幅波动，总体显示BMSCs生长旺盛。经分化培养，BMSCs细胞可分化成为内皮细胞，成骨细胞，脂肪细胞;经流式细胞学检测，BMSCsCD29，CD44，CD10，CD106表现阳性，而CD34，CD45表现阴性，符合骨髓间充质干细胞分子表型特征;2，LPS注射组和对照组相比，血浆PLT数量明显降低(P＜0.01)，Fib含量降低(P＜0.01），D-2聚体量偏高(P＜0.01），APTT(P＜0.01)和PT(P＜0.01)明显延长，而且肾脏，肺，肝脏，心脏组织切片经HE染色和PTAH染色均提示有微血管血栓形成。LPS注射组发生DIC。3，慢病毒转染293T细胞48小时后可见大量荧光，转染效率良好。病毒转染BMSCs后第5天，可见BMSCs荧光表达，BMSCs生长良好。不同MOI条件下病毒对BMSCs转染的效率不同，当MOI为12.5时，转染效率最高。经静脉注射GFP标记BMSCs三次后(每次间隔24h，剂量为1ml培养液含细胞数1×106)，取心肌组织切片，抗GFP过氧化物酶染色呈阳性，提示心肌内有BMSCs细胞存活。4，①和未经BMSCs预处理组相比，BMSCs预处理组血浆PLT(P＜0.01)和Fib(P＜0.05)含量高，而D-2聚体含量偏低(P＜0.01），而且，APTT(P＜0.05)和PT(P＜0.01)延长偏短，凝血状况较好;预处理BMSCs数量为1×105/次和1×106/次时最好。②与未经BMSC预处理组相比，BMSCs预处理组血浆TNF-α(P＜0.01)、IFN-γ(P＜0.01)、IL-1β(P＜0.05)浓度值均明显偏低，而且组间比较具有统计学意义;在预处理BMSCs数量为1×105/次和1×106/次时，TNF-α，IFN-γ和IL-1β值最低。③与未经BMSCs预处理组相比，BMSCs预处理组血浆ALT,Cr,CK-MB(P＞0.05)和ET(P＜0.05)浓度明显降低;组间比较发现Cr和ET水平的差异具有统计学意义;预处理BMSCs数量为1×105/次和1×106/次时Cr和ET水平最低。④各组肾脏，肺，肝脏，心脏组织切片经HE染色和PTAH染色均显示BMSCs预处理组器官纤维微血管血栓形成量较少，器官细胞损伤较小。预处理BMSCs数量为1×105/次和1×106/次时，纤维微血管血栓形成量最少，器官细胞损伤最轻。⑤BMSCs预处理对LPS诱导DIC大鼠的死亡事件的观察，结果提示三组大鼠（每组n=20）24小时内总生存率分别为:第一组34.2％，第二组51.3％，第三组64.5％，生存率比较P=0.02，有显著统计学意义;组间生存率比较，第一组VS第二组P=0.011，第一组VS第三组P=0.001，第二组VS第三组P=0.35。5，①和对照组相比，经BMSCs预处理组大鼠PBMC在LPS刺激下的增殖能力明显减弱。②LPS可明显刺激PBMC的增殖，但在BMSCs的影响下，这种刺激作用明显减弱(P＜0.05);在Transwell培养下，可达到同样效果(P＜0.05)。LPS刺激后，培养液炎性因子的浓度明显增加，但和BMSCs混合培养后，炎性因子释放增加的量明显减少，在Transwell培养中也有同样的表现。③和BMSCs混合培养时，LPS刺激PBMC的增殖明显减少，随着BMSCs数量越多，LPS刺激PBMC的增殖数量越来越少。和BMSCs混合培养时，培养液炎性因子的浓度开始减少，随着BMSCs量的增加，炎性因子的浓度越来越低。当BMSCs增加到一定浓度时，PBMC增殖量不再减少，炎性因子浓度也不再降低。
　　 结论:1，用密度梯度法进行BMSCs分离，贴壁法和机械刮除法进行BMSCs培养和体外扩增，可以获得形态较单一的BMSCs样细胞，细胞生长形态和状况良好，经流式细胞表型鉴定和多向分化培养鉴定证实为BMSCs。2，用LPS静脉推注可成功诱导建立Wistar大鼠DIC模型。此法操作简便，成功率高。LPS静脉推注可作为建立大鼠DIC模型的可靠方法。3，用慢病毒载体可成功转染GFP于大鼠骨髓间充质干细胞中，3次静脉注射(每次间隔24h)本实验所培养的GFP标记大鼠骨髓间充质量干细胞后，可在体内发现存活的BMSCs。4，BMSCs预处理可有效减轻LPS诱导大鼠DIC模型的器官损伤，抑制血管内凝血，提高大鼠生存率。这种保护性反应在一定范围内具有BMSCs注射数量依赖性，其机制可能与BMSCs对炎性介质分泌的调节有关。5，在体内和体外实验中，BMSCs均可抑制淋巴细胞增殖，调节炎性因子的释放，这种作用不依赖与细胞与细胞之间的直接接触，而且在一定BMSCs数量范围内，具有数量依赖性。

目录

声明

摘要

英文缩写及符号说明

前言

参考文献

第一部分 骨髓间充质干细胞的培养和鉴定

第一节：大鼠骨髓间充质干细胞的获取，培养，传代

材料与方法

结果

第二节：大鼠骨髓间充质干细胞定向分化培养

材料与方法

结果

第三节：大鼠骨髓间充质干细胞的流式细胞仪表型鉴定

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 LPS诱导大鼠DIC模型的建立

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 慢病毒介导GFP转染骨髓间充质干细胞及体内检测

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 BMSCs预处理对LPS诱导大鼠DIC模型的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第五部分 BMSCs对LPS刺激外周血淋巴细胞增殖影响的体外研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

英文论文一

英文论文二